第十章微生物分类,鉴定和菌种保藏方案
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法一、原理：1.休眠状态：微生物菌种在低温下可进入休眠状态，减缓代谢活动，延长存活时间。
2.冷冻保存：通过降低温度到零下或较低的温度，减慢微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
3.干燥保存：通过去除菌种周围的水分，降低微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
4.冻干保存：先冷冻再干燥保存，通过冷冻降低微生物体内的水分活性，再通过干燥去除冻结水，使菌种能在实验室条件下保存较长时间。
二、方法：1.冷冻保存：（1）使用离心管或培养管制备菌种的蛋白质保护液，可以是细胞培养基、缓冲液等。
（2）将培养物转移到保护液中，使其悬浮均匀。
（3）加入保护剂，如甘油或DMSO（二甲亚砜），提高菌种的冷冻抵抗力。
（4）将混合物分装到小容器或冻存管中。
（5）使用特定的冷冻方案，将菌种快速冷冻，并存储在低温下，通常为零下80℃或更低的温度。
2.干燥保存：（1）用无菌技术转移到无菌条件下的试管中。
（2）将菌种培养在无菌的固体培养基上。
（3）收集培养物，将其平均分布在无菌试管或培养皿中。
（4）将试管或培养皿放在无菌的通风柜中，使培养物在无菌环境下干燥。
（5）将干燥的培养物贮存在干燥无菌容器中。
3.冻干保存：（1）将培养物转移到无菌离心管或培养皿中。
（2）使用细菌培养基将菌种制备为细菌悬浮液。
（3）在细菌悬浮液中加入保护剂，如蔗糖或甘露醇。
（4）将混合物分装到冻干瓶中。
（5）使用低温冷冻机将菌种冷冻为固体，再将其放入冻结干燥机中进行冻干。
（6）将冻干的菌种贮存在密封的冻干瓶中。
4.长期保存：通常，冷冻保存和冻干保存可以实现长期保存，但仍需定期检测和维护保存条件。
在微生物菌种保藏过程中，还需注意以下几点：1.选择合适的保存条件：根据菌种的特性和要求，选择适宜的保存方法和温度。
2.制备合适的保存液：保存液的配方和pH值应与菌种相适应，以保证菌种的存活和精确性。
3.保持无菌操作：在菌种保藏过程中，需保持无菌操作，以防止细菌污染。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法微生物菌种保藏是指将微生物菌种保存在适宜的条件下，使其保持活力和遗传稳定性的方法。
随着微生物资源的日益减少，菌种保藏对于微生物研究和应用具有重要意义。
现今常见的微生物菌种保藏方法主要包括冷冻保存、冷冻干燥和液氮保存等。
I.冷冻保存法冷冻保存法是将微生物菌种在低温下保存，通常是在-80℃或更低的温度下。
冷冻保存的优点是简单易行，保存效果较好。
其步骤如下：1.选择合适的培养基和条件进行培养，确保菌种处于活跃状态；2.菌种分装，常用的分装方式有管内冻存和板块冻存两种。
管内冻存是将菌种转移到小试管中，加入一定的保护剂，如甘油，然后在-80℃下冷冻。
板块冻存是在无菌平板上涂布菌种，用无菌的干胶涂布，然后在-80℃下冷冻；3.将分装好的菌种保存在冷冻机或液氮罐中。
II.冷冻干燥法冷冻干燥法是将微生物菌种先进行冷冻，然后在真空条件下除去水分，最后进行密封保存。
冷冻干燥法的优点是菌种保存稳定性较好，不易失去活力。
其步骤如下：1.选择合适的培养基和条件进行培养，确保菌种处于活跃状态；2.将菌种在低温下冷冻，例如在-80℃冷冻24小时；3.将冷冻的样品放入真空干燥机中，通过极低的压力和温度，使水分从固态直接转变为气态，并在防止湿气生成的条件下除去水分；4.将干燥后的菌种用无菌胶瓶进行密封保存。
III.液氮保存法液氮保存法是将微生物菌种保存在液氮中，保证其温度处于极低的状态。
液氮保存法的优点是保存时间长，保存效果好。
其步骤如下：1.选择合适的培养基和条件进行培养；2.将菌种在低温下冷冻，例如在-80℃冷冻24小时；3.将冷冻的菌种转移到液氮罐中，确保菌种完全浸泡在液氮中；4.密封液氮罐保持其内部温度稳定。
总结起来，微生物菌种保存方法包括冷冻保存、冷冻干燥和液氮保存等多种方法。
科学选用适合的保存方法以及正确操作步骤，可以有效地保护微生物菌种的活力和遗传稳定性，为微生物研究和应用提供有力支持。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法微生物菌种保藏方法主要包括冷冻保存、冷冻干燥保存和鉴定保存等多种方式。
以下将逐一介绍这些方法。
冷冻保存是一种常用的微生物菌种保藏方法，它的原理是通过将菌种置于低温环境中，减缓细胞新陈代谢和繁殖，使菌株处于休眠状态，从而达到长期保藏的目的。
冷冻保存的步骤包括：培养优良菌株、制备菌种冻存液、冻存及复苏。
制备冻存液时，通常使用亲水性保护剂如甘油、乳糖等，以及抗冻剂如酪蛋白、卵黄等，混合菌株培养物与冻存液，并移液到冻存管中，放置于低温冷冻器中迅速冷冻。
复苏时，将冻存液迅速复苏并接种于适宜的培养基上，培养条件要注意逐步恢复菌株的新陈代谢活力，以避免菌株死亡。
冷冻干燥保存是一种将菌种置于低温和低压条件下脱水处理的保存方法。
冷冻干燥保存的原理是通过脱水将菌株处于休眠状态，并使用适当的干燥保护剂，如蛋白质、糖类等，保护菌株的细胞结构和功能。
制备冷冻干燥菌种的步骤包括：菌株预处理、菌株悬浮液制备、脱水处理、真空干燥、密封保存等。
制备菌株悬浮液时，通常使用含有保护剂的培养基，将菌株培养到对数期，制备含有菌株的悬浮液。
脱水处理时，将菌株悬浮液置于脱水试剂中，使其渐渐减少，最终减至约1%的含水量。
真空干燥时，将脱水后的菌株置于真空干燥器中，利用低温低压的条件下，使菌株中的水分转化为气态水分，实现菌株的干燥。
最后，将干燥的菌株装入密封容器中保存。
鉴定保存是一种将微生物菌株保藏在鉴定标本库中的方法。
该方法适用于那些已经得到准确鉴定和分类的菌株。
鉴定保存的步骤包括：菌株鉴定、鉴定数据记录、鉴定标本制备及识别、存储方法选择和管理等。
菌株鉴定时，通常使用形态学观察、生理生化特性分析以及16S rRNA序列分析等方法，确保菌株的准确性和可重复性。
鉴定数据记录时，要详细记录菌株的相关数据，如菌株来源、鉴定结果、鉴定依据等。
鉴定标本制备及识别时，可以通过制备菌株培养物、制备冻存液等方式保存菌株，并制备鉴定标本。
存储方法选择和管理时，要根据菌株类型和特性选择适当的保存方法，同时要做好菌株信息的管理和查询。
微生物菌种的保藏方法
微生物菌种的保藏方法1微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏是生物学研究的重要环节，它也是生物资源的基础。
微生物的保藏需要充分的考虑长期保藏的要求，能有效防止细菌的腐败，缩短菌株检疫和检测所需的时间，还可以提高细菌新特征的研究成果。
但是，由于不同物种之间的差异性，微生物菌种的保藏可能涉及各种复杂的方法，需要更加正确和有效的保藏来保护和维护菌株。
1.1定期替换培养基微生物菌种的保藏通常使用加入防腐剂的培养基进行贮藏，但是由于长时间的贮藏，培养基的成分会逐渐减少，菌株也会逐渐衰老，这可能会影响到菌株的存活率和活跃度。
所以，贮藏前应加入新鲜的培养基和抗生素，定期替换新鲜培养基，以保证菌株的流动性。
1.2贮存条件的控制正确控制贮存条件，如温度、湿度、控制空气的酸碱度等，可以使菌株的活跃性或存活率保持最佳状态。
一般来说，细菌能够在室温（25度）下长期贮存，但是会减慢其增殖和繁殖的速度，同时还要注意湿度，太过潮湿会使细菌存活率降低，尤其是嗜水性细菌；而太过干燥则会造成菌株衰老，影响菌株的存活率并降低其活力。
1.3贮藏容器的选择贮藏容器也是微生物菌种保藏的重要组成部分，不同种类的细菌需要不同种类的容器来保存。
一般来说，普通细菌能够在塑料袋或瓶中长期贮存，只需每隔一段时间就更换新的瓶或袋，但对于致病细菌则必须使用带有封闭口的易破袋。
1.4贮藏环境的更新贮藏环境的更新也是保藏细菌的重要环节。
定期更换菌种本身的培养环境，例如移动菌瓶到新的室温，或将菌瓶置于新的室温环境中，可以有效提高菌种的活跃性，同时也可以更换新的培养基和抗生素，定期更新贮藏环境，有效规避细菌衰老的问题，确保细菌的存活率和增殖率。
以上就是微生物菌种的保藏方法，主要涉及到定期替换培养基、贮存条件的控制、贮藏容器的选择以及环境的更新等，只有正确地运用它们，才能确保菌株的存活率和活动性。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法
微生物菌种的保藏是非常重要的，因为这些菌种可能用于各种实验和研究中。
以下是一些常见的微生物菌种保藏方法：
1. 冷冻保存：将菌种在液氮或-80的冰箱中冷冻保存。
这是最常见的保藏方法，能够长期保存菌株并保持其遗传稳定性。
2. 干燥保存：将菌种在无菌室中取出，用无菌纸或吸水纸吸干，然后放入无菌瓶中密封保存。
干燥保存适用于某些孢子或芽孢的微生物，比如放线菌、链霉菌等。
3. 明胶斜培养基保存：将菌种接种在含有明胶的固体培养基上，然后密封保存。
这种方法适用于某些菌株，如革兰氏阳性菌和厌氧菌。
4. 低温保存：将菌种保存在4的冰箱中。
这种保存方式可以在短时间内保持菌株的活性，但不能长期保存。
5. 液氮保存：将菌种在锅内预冷冷冻过的无菌玻璃管中加入10%甘油或蔗糖，然后立即在液氮中保存。
这种方法适用于大多数微生物，并且可以长期保存。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
微生物的分离培养和菌种保藏
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菌种保藏技术的改进
现有的菌种保藏技术存在一些局限性， 如长期保藏过程中菌种活力的下降等， 如何改进这些技术以提高菌种的保藏 效果是另一个挑战。
培养基和培养条件的优化
不同微生物对培养基和生长条件的需 求各异，如何优化这些条件以适应各 种微生物的生长是一个重要问题。
伦理和法规问题
在微生物分离培养和菌种保藏过程中， 可能涉及到伦理和法规问题，如人类 微生物、病原体和转基因微生物的管 理等。
未来的发展方向
开发新的培养方法和技术
随着技术的发展，未来将开发出更多新的培养方法和技术，以满足各 种微生物的培养需求。
提高菌种保藏效果
未来将致力于改进菌种保藏技术，提高菌种保藏效果，延长菌种寿命。
加强微生物多样性保护
未来将更加重视微生物多样性保护，采取有效措施保护珍贵的微生物 资源。
加强伦理和法规建设
选择性分离法
利用培养基或试剂的选择性抑 制某些微生物的生长，从而分 离出所需的特定微生物。
温度、酸碱度分离法
通过调节培养基的温度、酸碱 度等条件，使适应特定条件的
微生物得到分离。
微生物分离的步骤
1 2
采集样品
根据需要选择合适的微生物样品，如土壤、水、 空气等。
样品处理
将采集的样品进行适当的处理，如稀释、研磨等。
在医学和药学中的应用
抗生素耐药性研究
分离培养耐药性微生物，研究其耐药机制，有助于开发新的抗生 素药物。
疫苗制备
通过分离培养病原微生物，制备疫苗，预防和控制传染病。
药物筛选
微生物菌群的分离纯化、培养、鉴定及保藏
微生物菌群的分离纯化、培养、鉴定及保藏微生物纯培育分别技术菌种的分别纯化平板涂布法由于将微生物悬液先加到较烫的培育基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采纳稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学讨论中常用的纯种分别方法是涂布平板法。
用途：一般多用于从菌种的纯化；优点：可以观看菌落特征，对混合菌进行分别；缺点：不能计数；平板划线法最简洁的分别微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培育基表面多次作"由点到线'稀释而达到分别目的的。
划线的方法许多，常见的比较简单消失单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途：一般多用于筛选菌株。
一般用于平板培育基的回收率计数。
优点：可以计数，可以观看菌落特征。
缺点：汲取量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，简单扩散。
假如菌液密度大的话，长不出单菌落。
大肠菌种的培育鉴定菌种保藏试验材料和器材1.乳糖胆盐液体培育基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和胆盐组成，属液态、鉴别、增值、半合成培育液，试验中用于废水中菌群的培育；2.伊红美蓝琼脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、伊红-美蓝和琼脂。
琼脂平板用于分别纯化肠道致病菌，特殊是大肠菌群和粪大肠菌群；3.养分琼脂培育基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂。
用于分别纯化后的菌体培育。
试验方法和步骤1.试验支配试验预备；采样、恒温培育富集及初筛；观看产气状况及稀释、倒培育基、划线、涂布、倒置培育；鉴定、接种；菌种保藏。
2.详细操作步骤试验预备①配置培育基(伊红美兰琼脂培育基：7.4g+200mL无菌水、调pH7.2～7.4，养分琼脂培育基：6.6g+200mL无菌水、调pH7.40.2,0.85%生理盐水、乳糖胆盐液体培育基2.6g+100mL无菌水，调pH7.40.2),，装瓶，高压蒸汽灭菌。
②包扎好培育皿，移液管，试管，进行干热灭菌。
③将配好的乳糖胆盐液体培育基分装入三个试管中，每个大约十毫升，包扎，灭菌。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。
考研必备《微生物》第10章微生物分类鉴定
(根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程)
主要以细菌为例介绍微生物分类、命名和鉴定的有关知识
一、分类单元及其等级
界
门
纲
目
科 属
（参见P339）
种
根据Carl Woese的 理论，现在还在界 之上使用域(domain)
（把全部生物先分为 古生菌域、细菌域和 真核生物域， 域下面再分界。）
（参见P346）
（参见P360）
16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”
1）rRNA普遍存在于一切细胞内； 2）它们的生理功能既重要又恒定； 3）16SrRNA在细胞中含量较高、较易提取；
4）编码rRNA的基因十分稳定；
5）rRNA的某些核苷酸序列非常保守; 6）相对分子量适中。
利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家
(根据现有数据建立系统的过程)
命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有 的名称；
(分类系统建立过程中的步骤之一)
鉴定(identification或determination)：借助于现有的微生物分类
系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类
地位的微生物所应归属分类群的过程。
第10章
微生物的分类和鉴定
第一节：细菌分类
（参见P339）
分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、 研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。
分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：
分类、
命名、
鉴定
分类(classification)：根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育 相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成 系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的 微生物进行鉴定；
微生物菌种保藏原理与方法
1 简易保藏法
定期移植时间间隔： 一般不产芽孢的细菌约2周至1个月； 放线菌、酵母菌和丝状真菌4~6个月； 石蜡油封法一般可保藏1年。 优缺点：操作简单，可随时观察菌种生长状况，
但较费时费力，因经常移植传代，微生物物易 发生变异。
1.1斜面传代保藏法
贴标签：菌种 菌株 接种日期 接种：对数生长期后期 成熟的孢子 培养： 细菌—37℃，18~24h
收藏：面塞外包牛皮纸或用无菌橡皮塞，把菌种管直立 放置于4 ℃冰箱中。
放线菌、霉菌及产芽孢细菌一般可保2年，酵母菌及不 产芽孢细菌可保1年。
2 甘油保藏法
保护剂： 40%左右的甘油 机理：适当浓度甘油中，少量甘油分子进入细胞，
使菌种细胞在冷冻过程中缓解了其由于强烈脱水 及胞内形成冰晶而引起的破坏。 保藏温度：-20 ℃左右或-70 ℃ 特点:操作简单，保藏期长，保存期间取样测试方 便，在基因工程中常用于保存含质粒的菌株，一 般可保3~5年。
1.3石蜡油封法
石蜡油灭菌：将石蜡油装入三角瓶中，装量不超过总体 积的1/3，塞上面塞，外包牛皮纸，加压蒸汽灭菌（121 ℃ ，30min），连续灭菌2次。然后在40 ℃温箱中放置2 周或置105~110 ℃烘箱中烘2h，除去石蜡油中的水分。
培养
加石蜡油：以无菌吸管吸石蜡油加至菌种管中，加入量 以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约1cm为宜。
该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、 （除少数不产孢子或只产生丝状体真菌外）、 酵母菌及病毒的保藏。
该方法保藏菌种范围广、保藏时间长（一般可 达10~20年），存活率高，是目前最有效的菌 种保藏方法之一。
4冷冻真空干燥保藏法
安瓿管
5液氮超低温保藏法
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法微生物菌种保藏是指将微生物菌种保存在适宜的条件下，以保证其长期存活和遗传特性的保持。
微生物菌种的保藏有着重要的科研意义和应用价值，可以用于微生物学研究、新药研发、环境修复等领域。
微生物菌种保藏的原理主要包括冷冻保存和冷冻干燥保存两种方法。
冷冻保存是将微生物菌种存放在低温环境下，通过降低菌种代谢活动的速度来保持其存活和遗传特性。
冷冻保存的主要步骤包括选择合适的保藏液、培养菌种、制备冷冻物等。
保藏液一般是由无菌培养基和一定浓度的甘油或蔗糖组成，可以提供菌种所需的养分和保护菌体免受冷冻引起的损伤。
培养菌种时需要选择处于活跃生长期的菌株，通过适当的培养条件来使其保持较高的活力。
制备冷冻物时，可以将菌株转移到保藏液中，并在超低温环境下迅速冷冻。
冷冻干燥保存是将微生物菌种冻结后，通过真空干燥的方法除去水分，将菌种转变为无水状态，以提高其耐久性和保存时间。
冷冻干燥保存主要包括培养菌种、冻干物制备和密封保存等步骤。
培养菌种的方法与冷冻保存类似，选择合适的培养基和培养条件来培养活跃菌株。
冻干物制备时，将菌株转移到含有保护剂的培养基中，并通过冻结和真空干燥的过程除去水分，形成冻干物。
最后，将冻干物密封保存，避免受潮和污染。
微生物菌种保藏在实际操作中需要注意一些关键技术和管理要求。
首先，要确保保存的微生物菌株是原始菌株的纯种，并且具有所需的遗传特性。
其次，保藏液或冻干物储存容器应该具备良好的密封性能，以防止水分的进入和菌株的污染。
另外，保存的温度应该稳定在低温，通常为-80℃或更低的温度，以保证菌株的长期存活。
此外，对于长时间保存的菌株，应定期进行复苏培养，以确保其存活和活力。
总之，微生物菌种保藏是一项重要的技术，为微生物资源的保存和利用提供了有效的手段。
通过冷冻保存和冷冻干燥保存等方法，可以长期保留微生物菌种的遗传特性和活力，为微生物学研究和应用提供了可靠的资源。
在实际操作中，应遵循正确的步骤和管理要求，以确保菌种的质量和保存效果。
微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1.了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3.学习微生物的保藏及鉴定方法。
4.熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2.平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1.水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1.第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。
配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡，约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
微生物实验菌种保藏方案
一、石蜡油低温保藏法本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。
保藏温度要求在-4～4℃下。
液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。
具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm为宜。
二、甘油管冷冻保藏法1．试验方法介绍本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。
其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。
将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。
取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。
-20℃保存时间较短。
或采用体积比为8：2的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。
2．效果该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。
甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。
三、真空冷冻干燥法1．试验原理真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。
冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。
为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
第十章 微生物的分类鉴定
2.任务: 任务: 任务 分类,鉴定, 分类,鉴定,命名 3.定义: 定义: 定义 现代分类学基本上有两派 一派强调形态特征 一 现代分类学基本上有两派,一派强调形态特征 一派强调形态特征,一 派强调亲缘关系. 派强调亲缘关系. 形态特征————表现型 形态特征 表现型 亲缘关系————基因型 亲缘关系 基因型 按微生物的亲缘把它们安排成条理清楚的各种 分类单元或分类群的科学. 分类单元或分类群的科学.
其它术语: 其它术语
克隆:是从单个亲本细胞得来的细胞群体. 克隆 是从单个亲本细胞得来的细胞群体. 是从单个亲本细胞得来的细胞群体 菌株:是由纯培养的单个分离物的后代组成的 是由纯培养的单个分离物的后代组成的,菌 菌株 是由纯培养的单个分离物的后代组成的 菌 株通常是由单菌落衍生而来, 株通常是由单菌落衍生而来 而产生原始菌落的 菌数是未知的,故大多数菌株不被认为是克隆 故大多数菌株不被认为是克隆. 菌数是未知的 故大多数菌株不被认为是克隆. 菌株编号: 菌株编号 : 从自然界分离到的微生物尽管属于同 一个种,但由于它们来源不一样 但由于它们来源不一样,它们之间总会有 一个种 但由于它们来源不一样 它们之间总会有 些细微差异,这些同种但来源不同的纯培养体就是 些细微差异 这些同种但来源不同的纯培养体就是 不同的菌株. 通常用编号表示如7216,140等. 不同的菌株. 通常用编号表示如 , 等 群 :在自然界中有些微生物的种类其特征介于两 在自然界中有些微生物的种类其特征介于两 个种之间,彼此不易严格区分 彼此不易严格区分,于是我们就把这两 个种之间 彼此不易严格区分 于是我们就把这两 个种和介于它们中间的一些微生物统称为一个 "群".
(二)培养特征 二 培养特征 培养特征:
培养特征主要指 菌落特征: 菌落特征 1. 菌落大小 一般量直径 菌落大小,一般量直径 2. 形状 圆,扩展,不规则,变形虫状等. 形状:圆 扩展,不规则,变形虫状等. 3. 边缘 踞齿状 波形 放射状. 边缘: 放射状. 4. 隆起度 隆起度: 5. 透明度 半透明 透明 不透明. 透明度:半透明 透明,不透明 半透明,透明 不透明. 6. 质地 粘稠,疏松,紧密. 质地:粘稠 疏松,紧密. 粘稠, 7. 颜色 正面颜色 反面颜色. 颜色:正面颜色 反面颜色. 正面颜色,反面颜色 液体培养特征: 液体培养特征 1.混浊度 混浊度 2.有无沉淀 有无沉淀 3.有无浮膜及浮膜厚度 有无浮膜及浮膜厚度 4.半固体穿刺培养的生长及运动性 半固体穿刺培养的生长及运动性
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鉴定（Identification）：是指确定一个新分 离物是否归属于某个已命名的分类单元的过程。
一、微生物的分类单位
界（Kingdom）
门（Phylum or Division）
纲（Class）
目（Order）
关于变形细菌(Proteobacteria)纲 2
a-亚纲包括一大群形态、生理和营养类型（光能自养型、化能无机营养 型和化能有机营养型）等表型特征十分不同的细菌，如土壤杆菌 （Agrobacterium）、根瘤菌(Rhizobium)、红假单胞菌 (Rhodopseudomonas)、发酵单胞菌(Zymomonas)、副球菌等 (Paracoccus)、立克次氏体（Rickettsia）等。
亚种（Subspecies)
在种内，有些菌株在遗传学上关系密切，而且在表 型上仅存在较小的某些差异，在种内分成2个或2个 以上的分类单位，即为亚种
微生物亚种以下的变型分类
亚种以下
生物变型——表示特殊的生化或生理特征 血清变型——表示抗原结构不同 致病变型——表示某些寄主的专一致病性 噬菌变型——表示对噬菌体的特异性反应 形态变型——表示特殊的形态特征
(Fimibacteria)
放线菌纲
(Thallobacteria)
软壁菌纲(Tenericutes)
柔膜菌纲 (Mollicutes)
疵壁菌门 (Mendosicutes)
古细菌纲
(Archarbacteria)
二、关于变形细菌(Proteobacteria)纲 1
运用DNA/RNA杂交、16S rRNA编目法和16S rRNA序列 分析方法对革兰氏阴性细菌系统发育研究的结果相当一致。 在研究过程中，发现“紫细菌和相关细菌”，尽管在表型和 基因型方面很不一样即相当异源，但在系统发育树状图谱上 具有连续现象，相互之间的进化关系很为密切。1988年， Stackebrandt等将这类革兰氏阴性细菌命名为“变形细菌” （Proteobacteria），其下由a-亚纲、b-亚纲，g-亚纲、d亚纲和e-亚纲。
分类学(taxonomy)是研究物种的界定和序级确定。 系统发育关系(phylogenetic relationship)和分子进化 (molecular evolution)是两个密切相关的过程。
在利用现代分子生物学技术在分子和基因水平上获得大 量的分类单元尤其是种的遗传信息后，来推断和重建微 生物类群的演化历史和演化关系，即建立系统发育树。
d-亚纲由分解代谢的硫酸盐还原细菌、元素硫还原细菌，蛭弧菌 (Bdellovibrio)和黏细菌目(Myxococcales)的6个代表。
e-亚纲仅有弯曲杆菌(Campylobacter)和螺杆菌(Heliobacter)2属。
变形 菌纲 细菌
第三节 原核微生物的分类 鉴定方法
– Classification and Identification of Procaryotes
三、微生物系统发育分析
由于现代分子生物学技术的迅速发展，正在形成一 套与传统的分类鉴定方法完全不同的分类鉴定技术与 方法，从基因水平上分析各微生物种之间的亲缘关系， 即系统发育地位。
原核生物细胞中的16S rDNA 和真核生物细胞中的 18S rDNA的碱基序列都是十分保守的，不受微生物所 处环境条件的变化、营养物质的丰缺的影响而有所变 化，都可以看作为生物进化的时间标尺，记录着生物 进化的真实痕迹。因此，分析原核生物细胞中的16S rDNA 和真核生物细胞中的18S rDNA的碱基序列，比 较所分析的微生物与其他微生物种之间16S rDNA和 18S rDNA序列的同源性，可以真实地揭示它们亲缘关 系的距离和系统发育地位。
微生物的分类方法2
数值分类法又称阿得逊氏法
（Adansonian classification)
以两两菌株的形态、生理生化特征，对环境 的反应和忍受性及生态特征为依据
由计算机计算两者之间的总近似值，列出相 似值矩阵，将相似度高的菌株列在一起，然后 将矩阵图转换成树状谱（Dendrogram)(见下 一张）
分离菌株16S rRNA 基因的PCR扩增和序列测定的一般 步骤为：16S rRNA基因的PCR引物：5‘-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3’；5‘-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3’。 扩增反应体积50L，反应条件为95℃预变性5min， 94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进 行29个循环，PCR反应在PTC-200型热循环仪上进行。取 5L反应液在10g L-1的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
Phylogeny of the Living World-Overview
第一节 微 生 物 分 类 学
微生物分类学(Taxonomy)
是一门按微生物类群的亲缘关系把它们安排 成条理清楚的各种分类单元或分类群（Taxon） 的科学
分类学的任务
分类（Classification）：是指根据相似性或 亲缘关系，将一个有机体放在一个单元中
Bacteriology) 1923年, 1925年, 1930年, 1934年, 1939年,
1948年, 1957年, 1974年分别出版了第一至第 八版，1994年出了第九版 以形态、生理生化、G + C mol%、生态分布 等特征为主
《伯杰氏系统细菌学手册》
（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology) second edition 2001 以生理生化、G + C mol%、系统发育地 位等为主——体现了现代分子生物学的 研究成果
b-亚纲由Woese于1984年提出，包括的菌群有色杆菌属 (Chromobacterium)，水螺菌属(Aquaspirillum)，紫色杆菌 (Janthinobacterium)，德克斯氏菌(Derxia)，丛毛单胞菌(Comamonas)， 嗜木杆菌（Xylophilus）等。
g-亚纲由Weose1985年提出，包括了肠杆菌科(Enterobacteriaceae)， 气单胞菌科(Aeromonadaceae)，弧菌科(Vibrionaceae)，巴斯德菌科 (Pasteurellaceae)，假单胞菌(Pseudomonas)，海洋螺菌 (Oceanospirillum)，黄单胞菌(Xanthomonas)，溶杆菌(Lysobacter)等
细菌系统发育树
古菌的系统发育树
第二节 原核微生物分类系统
一、原核微生物伯杰氏分类系统 《伯杰氏细菌鉴定手册》 《伯杰氏系统细菌学手册》
细菌分类系统
最有代表性和最有影响的细菌分类系统 《伯杰氏细菌鉴定手册》 （Bergey’s Manual of Determinative
第十章 微生物的分类、鉴定
和菌种保藏
Taxonomy, Identification, Conservation of Microbiology
微生物分类鉴定目的
分类是人类认识微生物，进而利用和改造微 生物的一种手段，微生物工作者只有在掌握了 分类学知识的基础上，才能对纷繁的微生物类 群有一清晰的轮廊，了解其亲缘关系与演化关 系，为人类开发利用微生物资源提供依据。
系统发育研究方法
除了选择16S rDNA和18S rDNA作序列分析 进行系统发育比较外， 还可利用间隔序列 (ITS)、某些发育较为古老而序列又较稳定的特 异性酶的基因作序列分析，进行系统发育分析。 如在环境微生物研究中，对于谷胱甘肽转移酶 （GST）的基因序列分析所获得的系统发育鉴 定结果与用其他方法所获得的结果具有十分吻 合的一致性。
种名在后，第一字母小写。用拉丁形容词表示，描 述微生物的色素、形状、来源、病名、地名、某科学 家的名字等等
在种名后，附上命名者的姓和命名年份
微 生 物 的 命 名2
如命名对象是新种，需在种名后加n.sp (即novo species)
如仅泛指某一属的微生物，或某属微生物内的某些 种，则在属名后用sp.（单数时）或spp.（复数时）
系统学（systematics）
系统学（systematics）是研究生物多样性及其分类 和演化关系的科学。分子系统学是检测、描述并揭示生 物在分子水平上的多样性及其演化规律的科学。研究内 容包括了群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化 等领域。
群体遗传结构(population genetic structure)是指一 个种内总的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，是 一个种最基础的遗传信息。
微生物的数值法分类
微生物的分类方法3
化学分类法（Chemotaxonomy）
根据微生物细胞的特征性化学组成分对微生物进 行的分类方法
细菌细胞化学组分在分类上的应用
微生物分类方法4
遗传学分类方法
DNA中G+C含量百分比分析
细菌含量变化范围在25%~75%，放线菌在37% ~51%。 2 种之间差异超过10%，肯定不是同一个种
微生物的分类技术水平
微生物分类中使用的技术水平
细胞形态水平 细胞组分水平 蛋白质水平 基因组水平
微生物的分类方法 1
经典分类鉴定法
形态特征：个体 群体 生理生化特征：营养要求（碳源，氮源，生
长因子）；代谢产物（种类，产量，显色反应等）； 酶（产酶种类，反应特性等） 生态学特征：生长温度，对氧需要，酸碱要求， 宿主种类等 血清学反应 噬菌体的敏感性 其他
科（Family）
属（Genus）
种（Species）