微生物的计数_血球计数板法
血球样板计数实验报告
一、实验目的1. 掌握血球样板计数法的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用血球样板计数法对微生物进行计数。
3. 提高对微生物计数结果的分析能力。
二、实验原理血球样板计数法是一种利用显微镜直接计数微生物数量的方法。
该方法适用于各种微生物的计数，如细菌、酵母、真菌等。
计数原理是将一定稀释度的微生物悬液滴加到血球样板计数室中，在显微镜下直接观察并计数。
血球样板计数室由一块特殊的载玻片构成，其上有四条槽构成三个平台，中间较宽的平台被一短横槽隔成两半。
每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格。
每个大方格分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格。
每个大方格中的小方格总数为400个，每个大方格的边长为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm³。
计数时，通常只计数四个四周大方格内的细胞数。
然后求出每个大方格的平均值，即可得出一个大方格中的平均细胞数。
再根据菌液稀释倍数，计算出1ml菌液中的总细胞数。
三、实验材料1. 血球样板计数室2. 显微镜3. 试管4. 吸管5. 微量移液管6. 细胞悬浮液7. 稀释液8. 滤纸四、实验步骤1. 准备工作：将血球样板计数室及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2. 制备细胞悬液：将细胞悬浮液吸取少许，注入试管中，加入适量的稀释液，搅拌均匀。
3. 稀释：根据细胞悬液的浓度，将细胞悬液进行适当的稀释，以便在计数时细胞数适中。
4. 计数：将稀释后的细胞悬液吸取少许，滴加到血球样板计数室的盖片边缘，使培养液自然渗透填满计数室。
等待一段时间，让细胞全部沉降到计数室底部。
5. 观察：将计数板放在显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在的位置，然后转换到高倍镜观察。
计数四个四周大方格内的细胞数，记录下来。
6. 计算结果：根据计数结果和菌液稀释倍数，计算出1ml菌液中的总细胞数。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过血球样板计数法，得到酵母菌的计数结果为N个细胞/ml。
血球计数板计数法
精度高
血球计数板由精密的网格构成，能够精确地 计算细胞数量，误差较小。
样本用量少
血球计数板计数法需要的样本量较少，适用 于珍贵样本的计数。
缺点
主观性强
血球计数板计数法需要人工识别和计数细胞，因此容易受到主观因素 的影响，不同操作者之间可能存在差异。
无法计数非网格区域细胞
血球计数板上的网格区域有限，对于非网格区域的细胞无法计数，可 能会造成计数误差。
改进样本处理方法，提高细胞分散效果，降低细胞聚集现象， 提高计数的准确性。
增加血球计数板的网格密度，以减少计数误差，提高计数的准 确性。
将血球计数板计数法与其他检测方法相结合，如染色法、流式 细胞术等，以提高计数的准确性和可靠性。
06 血球计数板计数法：血常规检测中的血细胞计数
红细胞计数降低
常见于缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血等，也 可见于慢性病、肿瘤、月经期、孕妇等生理性贫血。
白细胞计数结果解读
白细胞计数正常值
成人（4.0~10.0） × 10^9/L，新生儿 （15.0~20.0） × 10^9/L。
白细胞计数升高
常见于感染、炎症、组织损伤、恶性肿瘤等，也可 见于生理性升高，如剧烈运动、体力劳动、月经期 和排卵期等。
常见于免疫性血小板减少症、再 生障碍性贫血、骨髓增生异常综 合征等，也可见于某些药物影响 或放化疗后骨髓抑制。
05 血球计数板计数法的优缺点
CHAPTER
优点
操作简便
血球计数板计数法是一种直接、快速的细胞 计数方法，操作简便，易于掌握。
适用范围广
该方法适用于各种类型的细胞计数，包括细 菌、红细胞、白细胞等。
总结词
血球计数板计数法在血常规检测中广 泛应用，用于准确计数红细胞、白细 胞和血小板等血细胞数量，为临床诊 断提供重要依据。
细胞数的测定(血球计数板的使用方法)
、目的与要求了解血球计数板计数的原理，学会测定细胞总数方法。
二、原理用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。
血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16x25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即25X 16），但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为 1 mm则每一个大方格的面积为 1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm,所以计数室的容积为0.1 mm3实磴圈-石血球计弦板杓构jfi三、血球计数板的使用方法（一）菌悬液的制备为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5〜10个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。
（二）加菌悬液样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。
由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。
静置5-10分钟。
（三）显微镜计数在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。
位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。
如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。
当芽抱菌体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。
（四）计数时若使用刻度为25X 16 （大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。
如用刻细胞数的测定D申決甌裕牧我度为16X 25 （大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80 小格）。
食品微生物实验技术--实验八血球计数板的使用及运用
五、思考题
1．计算每毫升(每克 所测样品的含菌数 ．计算每毫升 每克 所测样品的含菌数? 每克)所测样品的含菌数 2．用血球计数板测定微生物细胞数量有何 ． 优缺点?
5 .清洗：计数完毕后，血球计数 清洗： 清洗 计数完毕后， 板直接用水冲洗， 板直接用水冲洗，然后吸干或晾 最后用擦镜纸包好收藏， 干，最后用擦镜纸包好收藏，注 意不得用粗糙物品擦抹中央平板， 意不得用粗糙物品擦抹中央平板， 以免损坏小格刻度。 以免损坏小格刻度。
(二) 配制下次用培养基 二
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1.明胶液化培养基（试管柱体） : 28支/班 明胶液化培养基（试管柱体） 明胶液化培养基 支班 2.糖发酵培养基 每种糖28支/班 ,乳糖 2.糖发酵培养基: 每种糖28支/班 ,乳糖/葡 糖发酵培养基: 乳糖/葡 萄糖发酵液, 萄糖发酵液 9mL/支 支 3.淀粉培养基 三角瓶装 500mL /班 淀粉培养基(三角瓶装 淀粉培养基 三角瓶装): 班
4. 测定菌数：静置几分钟后，先置低倍镜下观察，找到中央平台上 测定菌数：静置几分钟后，先置低倍镜下观察， 的小方格网后，转换高倍镜进行计数。计数时，如用16× 规格 的小方格网后，转换高倍镜进行计数。计数时，如用 ×25规格 的计数板，则取左上，右上，左下，右下四种格(共 个小格)的 的计数板，则取左上，右上，左下，右下四种格 共100个小格 的 个小格 酵母菌数；如用25× 规格的计数板 则除了取左上，右上， 规格的计数板， 酵母菌数；如用 ×16规格的计数板，则除了取左上，右上，左 右下四个中格外，还需加数中央的一个中格(共 个小格 个小格)的 下，右下四个中格外，还需加数中央的一个中格 共80个小格 的 酵母菌。在分别求出100个小格或 个小格的酵母菌平均菌数后， 个小格或80个小格的酵母菌平均菌数后 酵母菌。在分别求出 个小格或 个小格的酵母菌平均菌数后， 按下式计算： 按下式计算： 每毫升菌液的菌数=每小格平均菌数× 每毫升菌液的菌数 每小格平均菌数×4000×1000×稀释倍数 每小格平均菌数 × ×
血球计数板的使用
•
• 样品中的菌数/ml= •
A1+A2+A3+A4+A5
80
X
?
X 稀释倍数
注意事项:
• 1、测定时，酵母菌液要摇匀，防止酵母 凝聚沉淀。 • 2、活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细 胞大小的一半时，即可作为两个菌体计 数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母 细胞。 • 3、位于格线上的酵母菌一般只计此格的 上方线及左方线上的菌体。
•计数室刻度有2种 •一种是 25中格X16小格 另一种为 16中格X25小格 •它们都是由400个 小格组成。
• 血球计数板的分区与分格
* * # #
# * *
#
#
• 例一 • 1大格=16中格 • =16 X 25小格 • =400小格
ห้องสมุดไป่ตู้
例二 1大格=25中格 =25 X 16小格 =400小格
结果记录：
• 微生物名称 总菌数 个/ml
第一个 第二个 第三个 第四个 第五个 中格 第一次 中格 中格 中格 中格
第二次 第三次
平均
血球计数板的构造（25×16）
放大后的网格
放大后的计数室
• 4、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方 线及左方线上的菌体。 • 5、计算方法： • 样品中菌数/ml=? • 若本实验采用25 x 16规格，要计数的全部小 格即?个小格。 • 设：每个中方格的菌数为A，则 • 每小格平均菌数=（A1+A2+A3+A4+A5)/80 • 计数室的容积？
微生物血球计数板直接计数法
此法是利用血球计数板在显微镜下直接进行 测定。它观察在一定的容积中的微生物的个 体数目，然后推算出含菌数，包括死活细胞 均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。 这样得出结果往往偏高。这种方法常用于形 态个体较大的菌体或孢子。
微生物血球计数板直接计数法
四、测定注意事项:
测定时，菌液要摇匀，防止菌液凝聚沉淀。
五、思考题：
• 1、用血球计数板计数时，哪些步骤易造 成误差？ • 2、血球计数板测定原理是什么？它有哪 些优点？
显微镜直接计数法 使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。活菌,死菌都计在内,与微 生物大小相同的杂质也计在内.
• 血球计数板的分区与分格 * * # #
# * *
#
#
• 例一 • 1大格=16中格 • =16 X 25小格 • =400小格
例二 1大格=25中格 =25 X 16小格 =400小格
4、计数方法： • 设：每个中方格的菌数为A，则 • 每小格平均菌数=（A1+A2+A3+A4+A5)/80 • 样品中菌数/ml=每小格平均菌数 ×4000 × 1000 × 稀释倍数 • 本实验采用25 x 16规格，要求数这些方格中的全部
小格即80个小格。
结果记录：
• 微生物名称 总菌数 个/ml
三、材与仪器：
• 1、待测样品：灵芝孢 子粉菌悬液 • 2、显微镜，血球计数 板，接种环,盖玻片等。
四、方法与步骤:
• 1、取洁净的血球计数板，在计数室上面盖上盖玻片。 • 2、取稀释到一定程度（3－4个/小格）孢子数，从 盖片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不 能有气泡。静置约5min，先在低倍镜下找到计数室 后，再转换高倍镜观察并计数。 • 3、如用16 × 25计数板，只计四个角上中方格的菌 数。若是25 ×16的计数板，除计数四个角上的中格 菌数外，还要计算中央中格的菌数。每个样品重复 计数2~3次。计数时应不时调节焦距，才能观察到 不同深度的菌体。如菌体位于中格的双线上，计数 时则数上线不数下线，数左线不数右线。以减少误 差。
微生物生长的测定
特点：快速、简便；但易受干扰。
8.生理指标法
▪测含氮量
蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分， 通过测含氮量就可推知微生物的浓度。
一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%， 根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含 量。
▪其他方法
▪测定微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热、消耗底物量、 产二氧化碳、产酸、粘度等，都可用于生长量的测定。
2.涂片染色法
应用：可同时计数不同微生物的菌数 适于土壤、牛奶中细菌计数。
方法：用镜台测微尺计算出视野面积； 取0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数； 计算公式：
每ml原菌液含菌数= 视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100 ×稀释倍数
3.平板菌落计数法
1ml 1ml 1ml
1ml
9ml
9ml
→或烘干→称重（干重）
7.比浊法
原理：菌体细胞在悬液中数目越多，越昏浊，光的穿透 力越弱，用比色计或分光光度计测定光密度OD，OD值 与菌液浓度成正比。
例：液体培养基中每隔2h抽样测OD值，结果如下： 时间 0 2 4 6 OD值 0.1 0.12 0.2 0.5
则6小时后菌体增长=(0.5－0.1)÷0.1=4倍 或对照标准曲线求出菌液浓度。该法快速、简便，
第二十四讲 微生物生长的测定
一、微生物生长表示法
描述微生物的生长情况，通常用群体增长量表示： 群体微生物细胞数目的增长情况； 群体原生质量的增长情况； 群体某些生理指标变化情况。
1.血球计数板法直接计数法 血球计数板
血球计数板法
原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中 均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换 算成单位体积中的细胞数。 适用范围：个体较大细胞如血球、酵母菌等。不适用于细 菌等个体较小的细胞，原因：细菌细胞太小，不易沉降； 油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌 悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。
实验五、微生物的计数——血球计数板法
实验五、微生物的计数——血球计数板法测定微生物细胞数量的方法很多，有分光光度法、显微直接计数法和平板计数法。
分光光度法比较简便，易操作，但是会使数据严重偏大。
而平板计数法则会使实验数据严重偏小。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。
两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
本实验采用血球计数板法，主要目的是了解血球计数板法的构造和使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。
一、实验目的与要求1、了解微生物计数常用的三种方法：分光光度法；平板计数法；血球计数板法。
2、了解血球计数板的构造和使用方法。
3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。
二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。
此法的优点是直观、快速。
将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。
由于计数室的容积是一定的（0.1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。
由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。
中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。
实训四微生物细胞数计数
使用血球计数板计数பைடு நூலகம்细胞微生 物的数量。
二、实验原理
血球计数板是一块比普通载玻片厚的特 制玻片制成。玻片中央刻有四条槽，中央两 条槽之间的平面比其它平面略低，中央有一 小槽，槽的两边的平面上各刻有9个大方格。 中间的一个大方格为计数室，它的长、宽各 为1mm，深度为0.1mm,容积为3。计数室有两 种规格，一种是把大方格分成16个中格，每 一中格分成25小格，共计400小格；另一种规 格是把大方格分成25中格，每一中格分成16 小格，总共也是400小格。
式中，400为计数板的小格总数； 10000为由计数室3换算成lmL体积的系数
三、实验材料和用具
1.材料 酵母菌悬液
2.用具 显微镜、血球计数板
四、实验方法
1.取清洁干燥的血球计数板，在计数室 上面加盖玻片。在显微镜下找到计数室。
2.取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片 边缘滴一小滴(不宜过多)。菌液可自行渗 入计数室。计数室不得有气泡，然后置高 倍镜下计数。
四、实验方法
3.样品浓度要求每小格内有5～10个菌体为宜。
4.计数时，用16×25的计数板要按对角线方位， 取左上、左下、右上，右下四个中方格(即100 小格)计数酵母菌液，用25×16的计数板，除 计数上述对角线的四个方格外，还需数中央一 个方格的酵母菌数(即80小格)。
四、实验方法
5.每个样品重复计数2～3次，取其平均值， 按上述公式计算每毫升菌液所含的酵母细 胞数。
6.计数完毕，将计数板在水龙头上冲洗，切 勿用硬物洗刷，自行晾干或吹风机吹干， 或用擦镜头纸轻轻擦拭。
五、实验内容
使用血球计数板对样品酵母菌液进行计 数，并计算菌液浓度。
六、实验报告
将微生物计数的结果填入下列空白 1.第一次计数的酵母细胞数目＝ 个。 2.第二次计数的酵母细胞数目＝ 个。 3.从两次的计数结果中求出酵母细胞的平均数目 4.稀释倍数＝ 倍。 5.求出每毫升酵母菌液中的细胞数＝ 个。
血球计数板计数法
5×400×10000×10＝2×108 。
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例6、 在用血球计数板（2mm×2mm方格）对某一稀释 50倍样品进行计数时，发现在一个计数室内（盖玻片下 的培养液厚度为0.1mm）酵母菌平均数为16个，据此估 算10mL培养液中有酵母菌 ▲ 个。
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计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个 大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25 个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分 成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格， 总共也是400小格。所以无论是哪种规格的计数 板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。 每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积 为1㎜2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的 高度为0.1㎜，所以计数室的容积为0.1㎜3。
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5.对每个样品计数三次，取其平均值， 计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。
第一室 第二室
各中格中菌数
A
B
二室平均值
12345
A-五个中方格的总菌数 B-稀释倍数
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菌数/ml 16
6．清洗血球计数板 血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切
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推导：1mm×1mm方格的计数
1mm×1mm表示计数室的边长，即一个大方格的边长。由于计 数室厚度为0.1mm，所以计数室的总体积为0.1mm3。
1．16×25型的计数公式： 酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100
×400×10000×稀释倍数
微生物计数法
微生物计数法1）血球计数板法:血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。
通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。
这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2）染色计数法：为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。
借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。
如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。
3）比例计数法：将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。
这种计数方法比较粗放。
并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。
4）液体稀释法：对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probablynumber）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。
该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。
5）平板菌落计数法：这是一种最常用的活菌计数法。
将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。
保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。
一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。
但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。
血球计数板实验报告
一、实验目的1. 熟悉血球计数板的使用方法。
2. 学习微生物计数的基本原理和操作技巧。
3. 通过计数，了解酵母菌种群数量的变化规律。
二、实验原理血球计数板是一种常用的微生物计数工具，其计数原理是将一定稀释度的微生物悬液滴入计数室中，在显微镜下直接计数。
血球计数板通常由厚玻璃制成，中间有两个计数池，每个计数池内画有9个大方格，大方格内再分为25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。
通过计数大方格内的微生物数量，可以计算出单位体积内微生物的总数。
三、实验材料1. 血球计数板2. 显微镜3. 酵母菌悬液4. 稀释液5. 移液器6. 试管7. 玻璃棒四、实验步骤1. 将血球计数板和盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2. 用移液器吸取适量酵母菌悬液，滴入计数池边缘，使悬液自行渗入计数池中。
3. 待悬液稳定后，将计数板置于显微镜载物台上，调整显微镜焦距，使计数室清晰可见。
4. 选择计数室中的一个大方格，按照从左上角到右下角的顺序，依次计数大方格内的微生物数量。
5. 计数完成后，计算每个大方格的平均微生物数量。
6. 根据稀释倍数，计算出单位体积内微生物的总数。
五、实验结果与分析本次实验共计数了5个大方格，每个大方格的平均微生物数量分别为：200、250、300、350、400。
根据稀释倍数，计算出单位体积内酵母菌的总数约为2.5×10^6个/mL。
从实验结果可以看出，酵母菌种群数量在一定时间内呈现增长趋势，这与酵母菌的生长特性相符。
六、实验总结1. 血球计数板是一种简单、方便、准确的微生物计数工具。
2. 在进行微生物计数时，应注意操作规范，避免误差。
3. 通过本次实验，加深了对微生物计数原理和操作技巧的理解。
七、注意事项1. 计数前应确保血球计数板和盖片干净、无尘。
2. 滴加悬液时，应避免产生气泡。
3. 计数时，应尽量保持显微镜焦距不变。
4. 计数过程中，应避免人为误差。
通过本次实验，我们掌握了血球计数板的使用方法，并了解了酵母菌种群数量的变化规律。
微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定
实验四 微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定 以及四大类微生物菌落形态的比较和识别微生物显微镜直接计数法一、实验目的1、学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。
2、学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。
二、实验原理酵母菌显微直接计数—血球计数板三、实验材料显微镜、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、吸水纸、擦镜纸.四、实验步骤1、取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。
2、取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。
3、用10×(40x)镜观察并将计数室移至视野中央。
4、在10×(40x)镜下计数：计数5个中格的平均值，最后再换算到每mL 菌液中的含菌数。
注意事项：计上不计下，计左不计右。
出芽计一半。
五、实验结果将显微计数结果记录于下表中。
T 表示五个中方格中的总菌数。
各中格中菌数T二室平均值个/ml12345第一室第二室六、问题与讨论在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？有何改进方法？②酵母菌死活细胞的鉴定一、实验原理美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。
二、实验材料酵母菌悬液、0.1 ％吕氏碱性美蓝染色液显微镜、载玻片、盖玻片。
三、实验步骤美蓝镜片的观察1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用吸取计数时酵母菌样品液放在染液中，混合均匀。
2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
3）将制片放置约1min后镜检，低倍镜到高倍镜观察，根据颜色来区别死活细胞。
注意事项1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。
细菌计数板和血细胞计数板的计数原理
细菌计数板和血细胞计数板的计数原理
细菌计数板和血细胞计数板是实验室常用的工具，用于帮助科
研人员和医学专业人员对细菌和血细胞进行计数。
下面将详细介绍
它们的计数原理。
1. 细菌计数板的计数原理：
细菌计数板是一种含有特定培养基的平板，通常被用于分析水
样或其他液体样品中的细菌数量。
其计数原理主要基于菌落计数法。
在实验中，将待测样品通过稀释系列后均匀涂布在细菌计数板表面，然后将其放入恒温培养箱中培养一段时间，使细菌在培养基上形成
可见的菌落。
最后，通过肉眼或显微镜观察并计数每个板上的菌落
数量，再根据稀释倍数和计数结果计算出原始样品中的细菌数量。
2. 血细胞计数板的计数原理：
血细胞计数板主要用于计数血液中的白细胞、红细胞和血小板
数量。
其计数原理基于血细胞计数法。
在实验中，将待测血液样品
与稀释液混合后装入计数板中，通过显微镜观察并计数每个小格中
的血细胞数量，再根据计数结果和稀释倍数计算出血液中各种细胞
的浓度。
同时，还可以通过染色方法区分不同类型的白细胞，从而
进一步了解血液的状况。
总的来说，细菌计数板和血细胞计数板都是通过对样品进行稀释、培养或染色处理后，利用显微镜观察和计数来确定细菌或血细
胞的数量。
这些计数板在医学诊断、环境监测和科研实验中都有广
泛的应用，为人们提供了重要的数据支持。
微生物实验显微镜直接计数法
1.血球计数板法
利用计数板上有固定体积和精确刻度的两个计数室进行
计数，是常用的在显微镜下对细胞数目进行计数的方法。
（1）计数室体积：正方形，边长为1mm，深0.1mm→盖上 盖玻片后，容积为0.1mm3。 （2）计数室刻度的规格
具有直观、快速等优点，但误差较大，不适合细菌计数。
16×25型：16个中方格，每个中方格分25个小格；
25×16型：25个中方格，每个中方格分16个小格。
计数室
（3）计数和计算方法
我们采用的是25×16的，计数时查5个中方格的总
菌数。如图：
5个方格的总菌数
计算：1个计数室的总菌数=A/5×25×B
稀释倍数
1g（ml）样品中的总菌数=A/5×25×10×1000×B
=50,000A×B个
三、实验材料
1.菌种：酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液(已
稀释100倍)
2.器具：显微镜、血球计数板、吸管、盖玻片。
四、实验步骤
1.检查计数板
检查计数板是否有破损。
2.镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物， 则需清洗后才能进行计数。
3.加样品
在清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用细口滴管 让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般
六、作业
显微直接计数结果
÷Ð · Ö · ½ · ñ Ö Ð ¾ ú Ê ý 1 Ú Ò µ » Ê Ò Байду номын сангаас ¶ µ þ Ê Ò 2 3 4 5
5个中格总数
þ Ê ¶ Ò
A
B
100
ú Ê ¾ ý /ml Æ ½ ¾ ù Ö µ
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微生物的计数——血球计数板法
【摘要】测定微生物细胞数量的方法很多，有分光光度法、显微直接计数法和平板计数法。
分光光度法比较简便，易操作，但是会使数据严重偏大。
而平板计数法则会使实验数据严重偏小。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。
两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
本实验采用血球计数板法，主要目的是了解血球计数板法的构造和使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。
一、实验目的与要求
1、了解微生物计数常用的三种方法：分光光度法；平板计数法；血球计数板法。
2、了解血球计数板的构造和使用方法。
3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。
二、基本原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。
此法的优点是直观、快速。
将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。
由于计数室的容积是一定的（0.1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。
由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。
中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方
格数都是相同的，即16×25=400小方格。
每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数
因1ml=1cm3=1000mm3，
=50000A·B（个）
同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则
三、实验材料
1）菌种：酿酒酵母菌
2）用品：显微镜、血球计数板、酒精灯、盖玻片、接种环、番红染液、胶头滴管。
四、实验方法
1、实验流程图
2、实验步骤
1）镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。
若有污物，则需清洗后才能进行计数。
2）将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。
3)取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
然后在显微镜下找到计数室。
若计数室沾有杂质或者菌体，要用蒸馏水冲洗计数板，用滤纸吸干其上的水分。
然后再放到显微镜下找到计数室。
4)将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。
5)静置片刻，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。
由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
6)计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。
如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。
如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
本实验采用25格×16格的血球计数板。
计数时应数5个大方格。
7)计数。
每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
8)测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
9）计算结果。
可用以下公式进行计算
（1）16格×25格的血球计数板计算公式：
细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数
（2）25格×16格的血球计数板计算公式：
细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数
五、实验结果
六、结论与分析
1、误差来源
本次试验中我们组用的是2号酵母培养液，是本次试验所用的酵母培养液中浓度最高的培养液。
但是经过老师分析，实验数据仍然偏大的一点。
产生这种误差的原因大概如下：
①酵母细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。
其中由于操作人员不注意细节，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filederror）。
②由于时间的关系，实验计数的次数太少，难以得到准确均匀的实验数据。
在实验过程中，操作人员也存在一定的不严谨性，导致实验结果产生误差。
由于
没有足够多的平行数据，难以用科学的计数方法进行结果的计算，因此难以得到比较准确的实验数据。
因此，搞好酵母细胞计数的质量控制一般需采用以下措施。
1）避免技术误差，纠正仪器误差
①所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。
②严格操作，从消毒、稀释、加样到计数都应规范，尤其应注意的是样品稀释要作到充分混匀。
必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。
2）缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或，而我们所能计数的细胞分布范围是有限的，由此造成的计数误差称为计数域误差或分布误差。
缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。
2、不足之处
血球计数板在显微镜下直接进行测定。
它观察在一定的容积中的微生物的个体数目，然后推算出含菌数，简便快捷。
但是在计数时包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。
这样得出结果往往偏高，因此适用于对形态个体较大的菌体或孢子进行计数。
七、思考题
1、试述血球计数板的计数原理。
为什么用两种规格不同的计数板计数同一样品，结果是一样的？
答：每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。
计数池画有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大方格，每个大格面积为1.0mm;.容积为0.1mm，中央大方格用双线分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域，用单线划分为16个小方格。
四角的4个大方格是白细胞计数区域，用单线划分为16个中方格。
血球计数板的计数原理：通过对一定数量的小格计数，
根据相应小格所占的体积，可以推算出单位体积的溶液中微生物细胞的密度和总数。
因为不同规格用不同的计算公式计算，最后得出的都是微生物细胞的密度和总数，所以结果一样。