项目四 发酵工业的无菌操作

常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角， 发酵罐罐底脓疱状积垢。
法兰连接不当造成的“死角”
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灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
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（4）设备渗漏染菌及防止
原因
发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，因加工制作不良 或遭受腐蚀等原因而形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
采用备用菌种或以无污染的适当菌龄的发酵罐内的发
酵液作为种子，接入新鲜培养基中进行发酵。
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（2）发酵前期染菌
发酵前期易染菌，且危害很大，需特别注意防止 一旦发现染菌，如原料营养还比较丰富，则进行重新灭 菌、接种发酵；如已消耗较多营养物质，则放掉部分料 液、补充新鲜培养基，重新灭菌、接种发酵。
1 2 加热灭菌法 辐射灭菌法 化学药品灭菌法 过滤除菌法
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4
二、发酵工业无菌操作的基本概念
灭菌：用物理或化学的方法杀死物料或设备
中所有的微生物。
消毒：用物理或化学的方法杀死空气、地表
措施
选用优质材料、科学合理加工、经常检查。
（5）操作失误染菌及防止
淀粉原料采用实罐灭菌，大颗粒应先筛去，再搅拌均匀，
加入一定量淀粉酶液化或糖化后灭菌。
在灭菌升温时，要打开排气阀门，排尽罐内冷空气。
严防泡沫升顶，可添加消泡剂防止泡沫的大量产生。 严格控制灭菌温度，避免蒸汽压力的波动过大。
发酵过程越来越多采用自动控制，控制仪器如用化学试剂
谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
种子 培养期
发酵 前期
发酵 中期
发酵 后期
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（1）种子培养期染菌
菌体浓度低、培养基营养丰富，较易染菌，应严格控 制。 若将污染的种子带入发酵罐，则损失更大，因此一经 发现，应立即灭菌丢弃，并对种子罐、管道等进行仔 细检查和彻底灭菌。
主要原因：
① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底
⑤操作失误
⑥技术管理不善

从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当 有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。

从杂菌种类看：
耐热芽孢杆菌：与④有关
球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
1.染菌对不同发酵过程的影响
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌

谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少
染杂菌，但噬菌体威胁大。

肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成
代谢产物。
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B.霉菌
PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发 酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。
采取哪些措施能够保持无菌发酵？

物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种 发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；

好气发酵通入的空气要除菌； 种子无污染；接种无菌操作过关； 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
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三、发酵工业的无菌操作技术
霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
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从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
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1）从污染杂菌的种类分析
污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底； 污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设
备渗漏或操作问题；
污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；
污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；
污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。
2）从污染时间分析
发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作
不当或空气带菌；
发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。
3）从染菌程度分析
多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题； 个别罐染菌：设备问题、操作不当。
项目四 发酵工业的无菌操作
发酵工业污染的防治策略
发酵工业无菌操作的基本概念
发酵工业的无菌操作技术 发酵培养基及设备管道灭菌
空气除菌
一、发酵工业污染的防治策略
什么是染菌？
即“杂菌污染”，是指在发酵培养中侵入了除 菌种外，有碍生产的其他微生物。
（一）污染的危害
杂菌大量消耗培养基中的营养物质，使生产菌的生产能力下降
发酵过程的异常现象
菌体生长差；
pH值过高或过低； 溶解氧水平异常； 泡沫过多； 菌体浓度过高或过低； CO2排放异常
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体 正常发酵
溶氧浓度
污染嫌气性杂菌
发酵时间 正常发酵
污染好气性杂菌
发酵时间
CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律
污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加
某药厂链霉素发酵染菌原因分析
1.污染杂菌的检测
检查杂菌的方法，要求准确可靠和快速，这样才
能在短时间内获得效果，主要方法有：
前3种检查法未发现
显微镜 检查 平板划 线检查 发酵过 程异常 观察 染菌，还不能肯定未被 染菌； 原因是以上检查法只 能检查杂菌浓度较大的
肉汤培 养检查
染菌情况（>1个/ml）
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（3）发酵中期染菌
中期染菌会造成发酵异常，产物产量下降，应尽力做到早
发现、快处理。
可通过加入一部分发酵旺盛的培养料，调节通风、温度、 pH等措施挽救，如发酵单位到达一定水平则可提前放罐。
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（4）发酵后期染菌
后期染菌对抗生素、柠檬酸发酵影响不大，但对氨基酸、 核苷酸等破坏较大。
污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
噬菌体是病毒的一种，是一种极微
小的生物，体积是细菌的1/1000左
右，它可以通过细菌过滤器，只有
在电子显微镜下才能看到。
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消除潜在的污染隐患-1
涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行； 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需 在无菌的环境下操作。 生物安全柜和超净台应注意清洁和消毒；每年更换HEPA过滤膜。

每一级种子培养物均应经严格检查，确保未受污染后才能使用
（2）空气带菌及其防止
空气的净化工艺和设备的设计 过滤介质的选用和装填 过滤介质的灭菌和管理等
（3）培养基和设备灭菌不彻底染菌及防止


原料含较多菌
未充分排除罐内空气


灭菌温度、时间未控制好
设备、管道存在死角
A.
原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均 匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；可 升温前搅拌和加淀粉酶。
C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌
D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒
素，都应全部废弃。
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（2）染菌种类对发酵的影响
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气
杆菌
四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌
杂菌产生的代谢产物，增加了发酵液中杂质类型或改变了发酵液理化
性质，从而导致增加了下游产物分离纯化的难度，造成产物收率降低或 产品质量下降。（降低发酵产率、提取得率、产品质量） 杂菌代谢会改变培养体系的pH，使发酵过程异常。 杂菌的代谢可能会降解产物，使产物得率降低。 若细菌的培养过程中被噬菌体污染，细菌细胞会破裂，造成发酵失败。
菌体相关垃圾处理： 生物安全柜或处理菌体的超净台应配备密封垃圾桶，以防止污染源外泄；
带有菌体的垃圾要做到当日灭菌；
如果当日不能灭菌，应使用垃圾袋密封后放置。
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消除潜在的污染隐患-6
分光光度计周围： 菌体相关的废液建议收集到专门密闭容器，每日灭菌；

盛放过菌液的比色皿应注意清洗，清洗液同上处理。
对过滤的影响
染菌后特别是污染细菌后，发酵液一般发粘，导致过滤
困难。
可采取加热、添加助滤剂等措施，或加絮凝剂使蛋白质
沉淀，有利于过滤。
4.染菌对产物提取和产品质量的影响
对提炼与产品质量的影响
染菌发酵液中含有较多水溶性蛋白和其它杂质。增加提 炼难度，增加产物提取成本，降低产物纯度。
二、杂菌污染的防治

部分发酵罐染菌： 个别发酵罐连续染菌：设备渗漏
4.杂菌污染途径及预防
（1）种子带菌及其防止 原因
：菌种培养或保藏过程染菌、培养基及用具灭菌不彻底、菌种移接
百度文库
过程污染
措施：

严格控制无菌室污染，严格无菌操作； 种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度； 培养和保存温度不宜有太大变化； 菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理 ；
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消除潜在的污染隐患-7
高压灭菌后的枪头，务必烘干使用
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消除潜在的污染隐患-8
玻璃器皿特别是菌体培养用器具使用前用铝箔包裹后，在180℃干热灭菌。
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消除潜在的污染隐患-9
培养装置应经常清洗消毒；
水浴摇床中的水要经常更换，长时间不用要将水排空，擦拭干净放置。
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消除潜在的污染隐患-10
B.
实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，
升温时，应打开排气等阀门放气。
C.
连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到
灭 菌温度，导致灭菌不彻底。
D.设备和管道存在“死角”
死角：由于操作、设备结构、安装或人为造
成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能
充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不
能达到彻底灭菌的要求。
3.污染原因的分析
染菌原因分析就是总结染菌的教训，防
范于未然。 主要染菌原因： ① 种子带菌 ④ 灭菌不彻底
② 无菌空气带菌
③ 设备渗漏
⑤操作失误
⑥技术管理不善
（1）染菌的时间分析

种子培养阶段：种子，灭菌，操作； 发酵前期：种子，灭菌，操作； 发酵后期：空气，补料，设备渗漏，泡沫
（2）染菌的杂菌种类分析：
污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底； 污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、
设备渗漏或操作问题；
污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；
污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；
污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。
（3）染菌的规模分析

大批量发酵罐染菌：种子、空气；
前期：种子带菌，灭菌问题； 中后期：空气带菌；
噬菌体的防治
严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；
净化生产环境，消灭污染源；
保证纯种培养，严防种子本身带噬菌体，特别是溶源性
噬菌体；
轮换使用菌种或使用抗性菌株。
2、染菌的处理
染菌后处理
染菌后必须对所有相关原料、仪器设备、管道等进行彻 底灭菌。 尽量查明染菌原因，以免重复污染。


3.污染原因分析
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消除潜在的污染隐患-2
使用胶头、移液器、电动移液器吸取溶液后，不能水平放 置，以防液体进入。 一旦液体进入要及时更换滤膜，并做好消毒措施。
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消除潜在的污染隐患-3
普通大肠杆菌的转化及划线后平板建议用石蜡膜完全密封后培养和放置。
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消除潜在的污染隐患-4
菌液培养时将盖拧紧
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消除潜在的污染隐患-5
发酵后期如染菌量不多，可继续发酵。如染菌严重，破坏
性较大，可提前放罐。
3.染菌程度对发酵的影响
发酵罐中的杂菌数量越多，即染菌程度越大，则对发酵 的危害越大。
如生产菌大量繁殖后，发酵物中含少量杂菌，如每升发
酵液中有1-2个杂菌，一般对发酵没有什么影响。
4.染菌对产物提取和产品质量的影响
4.染菌对产物提取和产品质量的影响
灭菌时
培养时
在培养时最好使用无菌的棉塞（不要使用铝箔覆盖培养瓶）；不 要使用潮湿或脏的瓶塞。
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Centrifuge & it’s rotor
Stands
接触菌体频率高，空隙多容易隐匿菌体的器具要经常清洗消毒。
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反复使用的电击槽
脏的移液器 与噬菌体污染的培养液 接触过的电极或buffer
灭菌，一定要彻底。
（6）噬菌体污染及其防治
染噬菌体对发酵的影响
发酵过程如受噬菌体侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵 迟缓或停止，而且往往会反复连续感染，使生产无法进行， 甚至使种子全部丧失，对发酵威胁很大。

噬菌体污染根本原因
生产中把活菌体排放到环境中，造成了自然界中相应噬
菌体大量增殖。 这些噬菌体随风沙尘土和空气流动到处传播，有可能潜 入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子 罐、发酵罐。