慢病毒载体,稳定表达
慢病毒感染问题全解答
A&Q|慢病毒感染问题全解答慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
它可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，可有效地感染分裂细胞和非分裂细胞，所以慢病毒载体能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，能够方便快捷地实现基因的长期、稳定表达。
在使用慢病毒的过程中，可能因病毒的浓度、细胞的状态、操作规范和时间把握等出现各种问题，今天小恒就来和大家聊一聊在其中可能会遇到的问题，以及如何解决这些问题~1.对照病毒或目的病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡，是否说明病毒有毒性?首先，确定病毒是否有支原体或细菌污染；其次，确定病毒感染MOI是否过高，梯度稀释后感染，寻找合适的MOI。
同时考虑目的细胞可能比较敏感，更换其它细胞感染确定病毒是否有问题。
病毒对某些敏感细胞有毒性可能是不可避免的。
如果以上都排除后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转2.病毒感染目的细胞效率低?和以下几个因素有关◆病毒活性解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融，-80℃保存半年以上需要重新测滴度；◆目的细胞最好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。
一些难感染的细胞，如贴壁不好的细胞，原代细胞等，或者体内动物实验适合用腺病毒或AAV；◆当然也和MOI值、感染时间以及是否加入polybrene等因素有关，可在实验中进行实当的摸索和调整，提升慢病毒的感染效率3. 如何确定向细胞中加入慢病毒的最佳时间？慢病毒感染细胞后2~3天可观察慢病毒携带的基因荧光表达情况，在细胞汇合度30~50%且细胞状态良好时加入慢病毒，确保在感染后2天时细胞增长达到70%左右的汇合度。
3.用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。
针对大部分细胞系：传代周期在2~3天，感染时细胞铺板的密度保持在30~50%左右针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到70~80%左右针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种4.慢病毒感染后什么时间基因表达到峰值慢病毒感染后大部分细胞会在3天左右GFP或目的基因表达达到峰值，但是对于生长缓慢的细胞，达到峰值的时间会更长。
利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒Cas9表达系统使用说明
慢病毒Cas9表达系统使用说明本说明书用于：¾构建Cas9蛋白表达细胞系¾在Cas9蛋白表达细胞系中敲除目的基因适用于以下产品货号货号pLV‐Cas9载体系列 CR2001，CR2002pLV‐Cas9‐Nick载体系列 CR2003，CR2004pGR载体系列 CR2011~CR2013pGR‐EGFP载体系列 CR2014~CR2016北京英茂盛业生物科技有限公司北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916Tel：010‐62495135Emai：order@Web site：目录1、产品简介 (2)1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理 (2)1.2慢病毒Cas9表达系统特点 (2)2、Cas9表达慢病毒制备 (3)2.1试剂准备 (3)2.2简要实验流程 (4)2.3实验前准备 (4)2.4病毒制备步骤 (5)2.4 PEG纯化慢病毒 (6)3、筛选Cas9表达稳定细胞株 (7)3.1 试剂 (7)3.2 实验前准备 (7)3.3 筛选细胞系实验步骤 (8)3.4 Cas9表达细胞系检测 (9)4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证 (10)4.1验证Cas9蛋白表达细胞系 (10)4.2验证Cas9Nicknase蛋白表达细胞系 (11)5、pGR和pGR‐EGFP载体构建 (13)5.1 pGR和pGR‐EGFP载体图谱 (13)5.2 靶点设计 (13)5.3 pGR载体构建步骤 (14)附录1 用到的产品 (17)附录2 引物列表 (17)11、产品简介1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。
在该机制中，Cas蛋白（CRISP‐associated protein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链。
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建邹斌;周学亮;詹宇亮;陈紫晴;赖松青;吴霞;刘季春【摘要】目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-H IF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.%Objective To establish the A549 cell line with stable expression of HIF1α by using lentiviral vector system.Methods Primers were designed and synthesized with human HIF1α gene coding sequence by the National Center of Biotechnogical Information(NCBI) as the template.HIF1α was amplified by PCR.The HIF1α fragment recycled by enzyme digestion was recombined with prepared lentiviral vector HBLV-RFP-Puro.The recombinant plasmid was identified by PCR and gene sequencing.The recombinant plasmid and the auxiliary plasmid were co-transfect into 293T cell.After filtration and concentration of packaged virus,the viral titer was detected by using the dilution counting method.The prepared lentivirus was infected A549 cells.The drug screening was adopted to stabilize the transfected cellline.The transfection effect was detected and observed by fluorescence microscope and Western blotting.Results The HIF1α fragment amplified by PCR was successfully verified and the recombinant plasmid was successfully constructed by PCR and gene sequencing identification.High-titer LV-HIF1α was obtained by successful package.After LV-HIF1α infecting A549 cells,the cells showed the red fluorescence by fluorescence microscope.The expression level of HIF1α in the LV-HIF1α group was significant higher than that in the control group by Westernblot.Conclusion The 549 cell line with HIF1α stable expression mediated by lentivirus is constructed successfully.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2017(046)020【总页数】4页(P2744-2746,2750)【关键词】HIF1α;慢病毒载体;稳定表达;A549【作者】邹斌;周学亮;詹宇亮;陈紫晴;赖松青;吴霞;刘季春【作者单位】南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心血管内科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院心胸外科,南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R734.2肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其导致的死亡人数居各类恶性肿瘤之首[1]。
慢病毒包装步骤及经验总结
慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的⼀种，它能够将靶基因导⼊到⼀些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从⽽⼤⼤增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若⼲代，可以进⾏稳转细胞株的筛选。
因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从⽽保证其⾼效表达并且对细胞不产⽣随机整合可能产⽣的伤害。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋⽩。
为产⽣⾼滴度的病毒颗粒，需要利⽤表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进⾏病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离⼼取得上清液后，可以直接⽤于宿主细胞的感染。
慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进⼊细胞后，在细胞浆中被其⾃⾝携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进⼊细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达⽬的蛋⽩或产⽣RNAi⼲扰。
慢病毒包装系统由⼀个包装质粒混合物（Mix）和⼀个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图⽚来⾃MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。
不同系统包装质粒混合物也不⼀样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，⽐例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋⽩的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因⼦rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。
以下介绍⽤293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。
准备试剂篇? 核⼼质粒；? 指数⽣长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 µg/µl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所⽤的包装病毒质粒也不⼀样，此系统可⽤于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例基因工程是一门通过DNA分子的重组技术来改变或者改造生物体基因结构的科学技术。
它不仅可以用于基础研究，还可以应用于医学、农业和工业领域。
在基因工程中，病毒载体作为一种重要的工具，具有许多独特的优势和广泛的应用。
本文将介绍病毒载体在基因工程中的优势，并举几个应用案例进行讨论。
病毒载体在基因工程中的优势之一是其高度选择性，可以将外源基因有效地嵌入到宿主细胞的基因组中。
病毒载体的基因组通常很小，可以携带和传递较长的DNA序列。
此外，病毒载体经过长时间的进化，已经具备了高度有效的侵染宿主细胞的能力。
利用这些特性，科学家可以使用病毒载体来将目标基因传递到特定类型的细胞中，从而实现基因工程的目的。
其次，病毒载体在插入目标基因时具有高效性。
病毒载体可以很容易地与外源基因重组，使得目标基因在宿主细胞中高效表达。
病毒侵染细胞的过程中，目标基因会被病毒载体运输并插入宿主细胞的基因组中，从而可以在细胞内产生目标蛋白。
这种高效的表达方式使得病毒载体在基因工程中得到了广泛应用。
病毒载体还具有广泛的宿主范围，可以感染多种类型的细胞。
这一特性使得病毒载体在基因工程中的应用更加灵活多样。
不同的病毒载体适用于不同类型的细胞，科学家可以根据需求选择合适的病毒载体进行基因传递。
例如，腺病毒载体可以感染多种哺乳动物细胞，而慢病毒载体则可以感染较广泛范围的细胞类型。
下面，我们将介绍两个病毒载体在基因工程中的应用案例。
第一个应用案例是利用腺病毒载体进行基因治疗。
腺病毒载体具有高度感染人体细胞的能力，被广泛应用于基因治疗领域。
基因治疗是一种将正常基因导入病人体内，以纠正遗传性基因缺陷或者改善疾病症状的方法。
例如，在严重联免疫缺陷病患者中，科学家使用腺病毒载体将正常的免疫系统基因导入患者的造血干细胞中，以恢复其免疫功能。
第二个应用案例是利用慢病毒载体进行基因敲除。
慢病毒载体具有稳定的遗传物质传递能力，被广泛应用于基因组编辑和基因敲除中。
RNAi、慢病毒、稳转细胞和原核表达简介
基因功能研究
通过构建稳转细胞系，研究特定 基因在细胞生长、分化、代谢等 方面的功能。
药物筛选
利用稳转细胞系进行药物筛选， 寻找能够调节特定基因表达或影 响细胞功能的药物。
疾病治疗
通过构建与疾病相关的稳转细胞 系，研究疾病发生发展的机制， 为疾病治疗提供新的思路和方法 。
04
CATALOGUE
原核表达
rnai技术的应用
应用
RNAi技术广泛应用于基因功能研究、药物发现和Biblioteka 发、以及治疗遗传性疾病和癌症等疾病。
举例
通过RNAi技术，科学家可以研究特定基因的功能，或抑制某些有害基因的表达以治疗疾病。此外， RNAi技术还可用于开发新型药物，通过沉默与疾病相关的基因来治疗各种疾病。
02
CATALOGUE
慢病毒
慢病毒的概述
慢病毒是一种逆转录病毒，属于 Retroviridae科，具有逆转录酶
活性。
慢病毒具有感染多种细胞类型的 能力，包括分裂细胞和非分裂细
胞。
慢病毒具有稳定整合基因到宿主 细胞基因组的能力，因此常用于
基因治疗和基因功能研究。
慢病毒的制备
慢病毒载体通常由包装细胞系（如293T细胞）转 染产生。
稳转细胞的制备
准备质粒
将目的基因克隆到表达载体中，构建稳定表 达质粒。
筛选稳定细胞系
通过药物筛选或克隆选择等方法，筛选出稳 定表达外源基因的细胞系。
细胞转染
选择合适的转染方法，如脂质体转染、电穿 孔等，将质粒导入目标细胞。
验证与鉴定
对获得的稳转细胞系进行鉴定和验证，确保 其具有预期的表型和功能。
稳转细胞的应用
此外，慢病毒还可用于建立稳 转细胞系，用于药物筛选和肿
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理慢病毒转染是一种常用的基因转染方法，适用于长期表达外源基因的研究。
慢病毒转染原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并将其整合入宿主细胞基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。
本文将从慢病毒转染的原理、步骤和应用等方面进行介绍。
慢病毒转染原理。
慢病毒转染的原理主要包括以下几个步骤，首先，将外源基因插入慢病毒载体中，构建成慢病毒表达载体；然后，将慢病毒表达载体转染至包装细胞中，利用包装细胞的辅助病毒蛋白包装慢病毒颗粒；最后，将包装好的慢病毒颗粒用于感染目标细胞，外源基因被整合入宿主细胞基因组中，实现稳定表达。
慢病毒转染步骤。
慢病毒转染的步骤包括慢病毒载体构建、包装细胞培养、病毒颗粒包装和目标细胞感染等。
首先，构建慢病毒表达载体时，需要选择合适的慢病毒载体和适当的启动子，将外源基因插入载体中，并经过序列分析和酶切验证。
其次，包装细胞的培养和病毒颗粒包装是慢病毒转染的关键步骤，需要选择合适的包装细胞系，转染慢病毒表达载体并培养包装细胞，最终收集包装好的慢病毒颗粒。
最后，利用包装好的慢病毒颗粒感染目标细胞，实现外源基因的稳定表达。
慢病毒转染应用。
慢病毒转染在基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域具有广泛的应用。
在基因功能研究中，可以利用慢病毒转染实现基因敲除、过表达和靶向修饰等，进而研究基因在生理和病理过程中的功能。
在基因治疗中，慢病毒转染可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和传染病等，为基因治疗提供了重要的技术支持。
在细胞工程中，慢病毒转染可以用于改良细胞系，提高细胞的表达稳定性和产量，满足生物制药和工业生产的需要。
总结。
慢病毒转染是一种重要的基因转染方法，具有稳定、高效、广泛应用等特点。
通过慢病毒转染，可以实现外源基因在宿主细胞中的稳定表达，为基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域提供了重要的技术支持。
因此，深入理解慢病毒转染的原理和步骤，对于开展相关研究具有重要的意义。
HSP27慢病毒载体的构建及其稳定表达细胞株的建立
中国兽医科学 2021,51(01): 105-112Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-ll-ll D O I：10.16656/j.issn. 1673-4696.2021.0006 中图分类号：S852.65 文献标志码：A文章编号：1673-4696 (2021) (U-0105-08 HSP27慢病毒载体的构建及其稳定表达细胞株的建立马瑞仙u,牛宇辉u,吴贝u，李向葺i许淑娟A李琼毅'柏家林'冯若飞“2*(1.西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030;2.西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州730030;3.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)摘要：热休克蛋白27(HSP27)是一种结构上高度保守的小分子热休克应激蛋白，它可通过与细胞自 噬、细胞凋亡和天然免疫信号通路关键因子相互结合参与多种病毒的感染过程。
为了便于深入研究HSP27 在机体抗感染免疫中的作用，用P C R方法从A549细胞中扩增出HSP27片段，然后经双酶切、连接、转化等 步骤获得HSP27的慢病毒表达栽体pTRIP-HSP27，将此栽体和另一对照栽体pTRIP-E G F P分别转染至 HEK-293T细胞中，48h后收集慢病毒将其转导至A549细胞，经嘌呤霉素筛选获得过表达HSP27的细胞株 A549-HSP27 和过表达 EGFP 的对照细胞株 A549-EGFP。
最后，经RT-qPCR、Western-blotting、IFA 和细胞 活力检测等方法进行鉴定，获得了能稳定表达HSP27的细胞株。
关键词：热休克蛋白27;慢病毒；稳定细胞株Construction of HSP27 lentiviral vector and establishment of its stableexpression cell linesMA Rui-xian13,NIU Yu-hui13,WU Bei13,LI Xiang-rong''2,XU Shu-juan''3,U Qiong-yi1'3,BAI Jia-lin12,FENG Ruo-fei12*(1. Key Laboratory of Biotechnology & Bioengineering of State Ethnic Affairs Commission .Biomedical Research Center,Northwest Minzu University,Lanzhou 730030yChina；2. Biomedical Research Center,Northwest Minzu University,Gansu Animal Cell Technology Innovation Center,Lanzhou 130030,China；3. College of Life Science and Engineering,NorthwestMinzu University,Lanzhou730030, China)Abstract：Heat shock protein 27(HSP27) is a small heat shock stress protein with highly conserved structure. It can participate in the infection process of various viruses by interacting with key factors of autophagy,apoptosis and innate immune signaling pathways. In order to further study the role of HSP27 in anti-virus immunity,HSP27 was amplified from A549 cells by PCR,and then the recombinant lentiviral expression vector pTRIP-HSP27 was obtained by double enzyme digestion,ligation and transformation. Then,pTRIP-HSP27 and the control vector pTRIP-EGFP were transfected into HEK-293T cells respectively. After 48 hours,lentivirus was collected and transferred to A549 cells. Finally,these sta- ble cell lines A549-HSP27 and A549-EGFP were identified by RT-qPCR,Western-blotting,IFA and cell viability assay.Key words：heat shock protein 27;lentivirus;stable cell lines* Corresponding author：FENG Ruo-fei,E-mail ：fengruofei@xbmu. edu. cn收稿日期：2020-09-18;修回日期：2020-11-02基金项目：西北民族大学中央髙校基本科研业务费资金项目（31920190003,31920200003);国家民委中青年英才培养计划 项目[批准号（2018)98];教育部“创新团队发展计划”项目（IRTJ7R88)作者简介：马瑞仙（1994-)，女，宁夏银川人，硕士生，主要从事分子病毒学方面研究，E-mail:*****************。
稳定表达猪德尔塔冠状病毒N_蛋白的Vero_细胞系的建立及鉴定
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒（PDCoV ）核衣壳（N ）蛋白的非洲绿猴肾（Vero ）细胞系，本研究将PDCoV-N 基因克隆入慢病毒载体中，获得重组质粒pLVX-PDCoV-N ，利用慢病毒包装系统转染293T 细胞，包装成表达N 蛋白的慢病毒颗粒，慢病毒感染Vero 细胞，嘌呤霉素加压筛选目的细胞。
RT-PCR 扩增N 基因和测序表明细胞系基因组中存在N 蛋白编码序列，Western blot 和IFA 试验表明N 蛋白可在细胞系中稳定表达。
应用制备的细胞系对临床PDCoV 阳性血清样品进行检测，与ELISA 检测结果符合率达到100%。
本研究成功建立了稳定表达PDCoV N 蛋白的Vero 细胞系，为PDCoV N 蛋白生物学特性研究和PDCoV 的临床检测、流行病学调查奠定了基础。
关键词：猪德尔塔冠状病毒；核衣壳（N ）蛋白；慢病毒；稳转细胞系中图分类号：S858.28 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2024）01-0056-06Establishment and Characterization of a Vero Cell Line Stably Expressing NProtein of Porcine DeltacoronavirusQIAN Bingxu 1,2, BO Zongyi 1,3, BAI Xueyan 1, ZHANG Chengcheng 1, GUO Mengjiao 1, LI Mengjiao 1,LIAO Kai 1,2, XUE Feng 2, WU Yantao 1, ZHANG Xiaorong 1(1. College of V eterinary Medicine of Y angzhou University, Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Y angzhou 225000, China; 2. International Cooperative Laboratory for Animal Health and Food Safety, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, Ministry ofEducation of China, Y angzhou University, Y angzhou 225000, China)收稿日期：2021-08-23基金项目：扬州大学高端人才支持计划；江苏高校优势学科建设工程资助项目作者简介：钱炳旭，男，博士研究生，主要从事动物传染病防控研究；薄宗义，男，助理研究员，主要从事动物传染病防控研究通信作者：张小荣，E-mail：***********.cn稳定表达猪德尔塔冠状病毒N 蛋白的Vero 细胞系的建立及鉴定钱炳旭1,2，薄宗义1,3，白雪雁1，张成成1，郭梦娇1，李梦娇1，廖 凯1,2，薛 峰2，吴艳涛1，张小荣1（1.扬州大学兽医学院 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225000；2.南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室，南京210095；3.扬州大学农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，扬州225000）2024,32(1):56-61Abstract: To obtain a African green monkey kidney cell (Vero) line stably expressing nucleocapsid (N) protein of Porcine deltacoronavirus (PDCoV), the PDCoV N gene was cloned into a lentiviral vector to obtain the recombinant plasmid PLVX-PDCoV-N. Then, the recombinant plasmid PLVX-PDCoV-N was transfected into 293T cells by lentivirus packaging system and packaged into lentivirus particles for N protein expression. Vero cells were infected then with the lentivirus and the target cells were screened by puromycin. The results of RT-PCR and sequencing of PCR product showed the genome of the resulting Vero cell line containing N gene. The N protein that was stably expressed in the Vero cell line was confi rmed by Western blot and IFA. The Vero cell line was used to detect clinical PDCoV positive serum samples and the coincidence with the results of ELISA was 100%. The study successfully established a· 57 ·钱炳旭等：稳定表达猪德尔塔冠状病毒N 蛋白的Vero 细胞系的建立及鉴定第32卷第1期猪德尔塔冠状病毒（Porcine delta coronavirus, PDCoV）是近年来新发的冠状病毒，2012年在中国香港被首次报道[1]，2014年在美国首次出现大规模流行[2-3]。
KIF5B-RET慢病毒载体构建及稳转细胞系的建立
KIF5B-RET慢病毒载体构建及稳转细胞系的建立摘要将 KIF5B-RET序列连接到Lenti6.3-eGFP上，重组获得慢病毒载体，包装生产慢病毒并测定其滴度，再将此慢病毒转染肺癌细胞系并筛选验证。
本实验成功构建了KIF5B-RET慢病毒载体，并建立稳定表达KIF5B-RET的肺癌细胞系。
关键词 KIF5B-RET基因；慢病毒载体；肺癌细胞一、引言RET（rearranged during transfection）融合基因是新发现的肺腺癌驱动基因，已成为独立的新的分子亚型[1]。
Cabozantinib等几种市售的多靶点激酶抑制剂均能抑制RET激酶活性[2]，但特异的小分子抑制剂需进一步研究开发。
慢病毒表达载体具有高转染效率，目的基因可整合到宿主细胞基因组中，且长期表达。
本研究通过成功构建KIF5B-RET基因慢病毒载体，建立稳定表达 KIF5B-RET的肺癌细胞系，为药物开发及筛选奠定基础。
二、材料与方法1.材料慢病毒载体 pLenti6.3_MCS（图1）购自Invitrogen公司，KIF5B-RET融合基因质粒由本实验室保存。
293T细胞购自中科院上海细胞库。
限制性内切酶 PacI、AscI、T4 DNA ligase购自NEB公司。
Lipofectamine2000购自 Invitrogen 公司。
质粒提取、胶回收试剂盒购自Biomiga公司。
2. 慢病毒表达载体的构建及鉴定用PacI / AscI把质粒37℃酶切2小时，电泳回收后，用T4 DNA ligase连接回收的片段与载体。
取10ul连接产物转化感受态细胞DH5a。
涂平板挑取单克隆摇菌，质粒中抽试剂盒提取质粒。
3. 病毒包装取 293T细胞按照每个10cm的培养皿6x106个细胞数铺板。
第2天，取9ug PackagingMix和 3ug慢病毒质粒加入1.5ml Opti-MEM混匀。
取36ul lipofectamine2000 加入1.5 ml Opti-MEM中，混匀后将3ml复合物加入到细胞中过夜，换用培养基后培养3 d，收获细胞培养上清，分装，－80℃保存。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够长期潜伏在宿主细胞内，并且在细胞分裂时能够传递给子细胞的病毒。
慢病毒的研究和应用在基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域具有重要意义。
慢病毒载体构建是慢病毒研究的关键环节，下面将介绍慢病毒载体构建的原理。
首先，慢病毒载体构建的关键是选择合适的病毒骨架。
常用的慢病毒载体包括HIV-1、HIV-2和SIV等。
这些病毒骨架具有较高的转导效率和稳定性，能够有效地将外源基因导入宿主细胞中。
在选择病毒骨架时，需要考虑到载体的稳定性、毒性和转导效率等因素，以确保慢病毒载体能够在宿主细胞中稳定表达外源基因。
其次，慢病毒载体构建需要将外源基因整合到病毒基因组中。
一般来说，外源基因会被整合到病毒的长末端重复序列（LTR）之间，这样可以确保外源基因能够稳定地表达。
在整合外源基因时，需要使用逆转录酶将外源基因的RNA转录成DNA，并将其整合到病毒基因组中。
整合外源基因的位置和数量会影响慢病毒载体的稳定性和表达水平，因此需要对整合位点和整合数量进行精确控制。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的包装限制。
在病毒的生命周期中，病毒颗粒的组装和包装需要依赖于病毒的包装信号。
因此，在构建慢病毒载体时，需要确保外源基因的整合不会影响到病毒的包装信号，否则会影响病毒的组装和包装，从而降低病毒的转导效率和稳定性。
最后，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
在构建慢病毒载体时，需要对病毒的毒性进行改造，以降低其对宿主细胞的损害。
同时，还需要对病毒的复制和传播进行限制，以确保慢病毒载体在宿主细胞中稳定表达外源基因，同时不会对宿主细胞造成不良影响。
综上所述，慢病毒载体构建是慢病毒研究和应用的重要环节。
通过选择合适的病毒骨架、整合外源基因、考虑病毒的包装限制和确保病毒的安全性和稳定性，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域的研究和应用提供重要支持。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。
慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。
本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。
首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。
慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。
因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。
其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。
常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。
而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。
此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。
总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。
通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。
慢病毒载体相关知识问答大总结
慢病毒载体相关知识问答大总结慢病毒包装技术专题Q:什么是慢病毒 ?A: 慢病毒载体 (Lenti vector)是用于感染细胞以实现稳定导入基因或siRNA的病毒载体系统，其感染效率可以达到100%。
慢病毒和细胞结合后通过包装蛋白将含有目的基因或者干扰序列释放到细胞内。
慢病毒RNA通过逆转录酶转录为DNA。
DNA整合前复合体进入细胞核并整合到靶细胞的染色体DNA。
由于靶基因或基因干扰序列整合到染色体上并且伴随着细胞分裂时DNA的复制一起复制，基因的导入能够获得稳定的表达。
慢病毒的显著优势在于其可以整合到非分裂细胞，而其他载体(如非病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)不具备整合到靶细胞染色体的特性，或者只能整合到分裂细胞的染色体(如常规的逆转录病毒)。
目前我们使用的慢病毒载体是基于HIV-1改造而来，该载体使用最为广泛，经过科学家的多次改造在包装滴度和使用平安性等方面都特别抱负。
在实际的使用中我们可以用来表达目的基因或目的基因加上报告基因，近年来随着RNAi 讨论的深化，越来越多的科学家用慢病毒载体来表达干扰序列. Q:慢病毒用于rna i讨论A:目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的讨论中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采纳事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是由于RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3端形成1~4个U。
慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响
慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响纪玉婷;杨燕;郑荣生;张吴琼;刘静【摘要】Aim To construct a lentiviral vector for stable delivery of the connexin32 (Cx32) gene in human hepatocellular carcinoma cell lineHuh7,and also to detect its effect on cell proliferation.Methods Human Cx32 gene sequence was obtained by whole gene synthesis and amplified by PCR,and was then inserted into LV5-GFP lentiviral vector to construct the recombinant plasmid LV5-GFP-hCx32.Following identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing,this plasmid together with lentiviral package plasmid was transfected into 293T cells to produce the lentiviral particles,and the viral titer was assessed under fluorescent microscope.Targeted Huh7 cells were infected with the lentivirus (LV5-hCx32 and LV5-NC),and the infected cells after selection with puromycin were amplified and cultured.The expression and localization of Cx32 were detected by real-time RT-PCR,Western blot and immunofluorescence assay,respectively.The gap junction (GJ) function between adjacent cells was measured by dye transfer assay.The Huh7 cell proliferation capacity was determined by MTT and colony formation assays.Results The results of double enzyme digestion and DNA sequencing proved that the recombinant lentiviral vector LV5-GFP-hCx32 was successfully constructed.After packing in 293T cells,the recombinant lentivirus LV5-GFP-hCx32 with virus drops to 3 × 1011 TU · L-1 wasobtained.Huh7 cells transiently infected with the lentivirus LV5-GFP-hCx32 remarkably over-expressed Cx32 at both mRNA and proteinlevels.Moreover,Cx32 expression was also significantly up-regulated in stably transfected Huh7 cells,and the presence of enhanced functional GJ in intact cells could be detected due to an increased amount of Cx32 protein along the plasma membrane at cell-cell pared toLV5-NC group,the proliferation ability in Huh7 cells with recombinant Cx32 declined (P ＜ 0.05).Conclusions The lentiviral vector over-expressing Cx32 gene is successfully constructed,and can stably transfect Huh7 cells to yield sustained over-expression of exogenous Cx32 gene,thus eventually inhibits cell proliferation.%目的构建LV5-hCx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响.方法采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-hCx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度.将慢病毒载体LV5-hCx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养.qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化.结果双酶切及测序结果表明LV5-GFP-hCx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×1011TU·L-1的重组慢病毒LV5-GFP-hCx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ.过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P＜0.05).结论成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2018(034)002【总页数】6页(P284-289)【关键词】肝细胞癌;缝隙连接蛋白32;慢病毒;载体构建;稳定转染;治疗靶点【作者】纪玉婷;杨燕;郑荣生;张吴琼;刘静【作者单位】蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R373.9;R735.7;R735.702.2;R977.6消化道肿瘤是人类面临的重大难题，原发性肝癌是消化系统肿瘤的重要构成，其中约90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理
慢病毒转染是一种常用的基因传递技术，它利用慢病毒病毒粒子作为载体将目标基因导入靶细胞。
慢病毒是一类特殊的病毒，具有较高的感染效率和稳定的基因表达能力，因此被广泛应用于基因转染领域。
慢病毒转染的基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 构建慢病毒载体：首先，将目标基因插入到慢病毒载体的适当位点上。
慢病毒载体通常包括了病毒的基因组结构，例如表达型蛋白、包装型蛋白等。
2. 包装慢病毒：将构建好的慢病毒载体导入特定细胞系，并通过培养和传代扩增病毒。
这些细胞会产生足够多的慢病毒病毒颗粒。
3. 收集病毒颗粒：从培养基中收集慢病毒病毒颗粒。
通常，病毒颗粒可以通过浓缩和超速离心等方法获得。
4. 转染靶细胞：将收集到的病毒颗粒加入待转染的靶细胞培养基中。
病毒颗粒会与细胞表面的受体结合，进入细胞。
5. 病毒基因组整合到靶细胞基因组：一旦进入细胞内，慢病毒会释放出自己的遗传物质，包括病毒基因组RNA和逆转录酶。
逆转录酶能够将病毒基因组的RNA逆转录成DNA，并将其整合到宿主细胞的染色体上。
从而实现病毒基因的稳定表达。
综上所述，慢病毒转染是一种利用慢病毒病毒粒子作为载体将基因导入到靶细胞的技术。
通过包装慢病毒病毒颗粒，并与靶细胞进行转染，实现了基因的稳定表达。
这种技术在基因治疗、基因功能研究等领域具有重要的应用价值。
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慢病毒载体，稳定表达
一、慢病毒
逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。
主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：
2个调节基因：
（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：
（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；
（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：
1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；
2.可感染分裂和非分裂细胞；
3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；
4.可以更换特异性启动子；
5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体
慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。
慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物）
三、慢病毒的使用和优势
慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度
滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。
单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位）
检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。
实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。
图3
MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。
指感染时病毒和细胞数量的比值。
在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。
加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。
最后，818 一些有关慢病毒方面的产品：
1.关于慢病毒载体构建方面：
ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】
shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】
miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】
Cas 9 和sgRNA克隆产品【LPP-CP-LvC9NU-载体-100，Cas9 慢病毒】
2.慢病毒包装服务方面（慢病毒颗粒，病毒浓缩，包装细胞系等）
LT001，基于HIV骨架的慢病毒颗粒包装试剂(20 reactions)
LT005，基于qRT-PCR技术的HIV骨架慢病毒颗粒滴度检测试剂（20次RT反应+50次PCR 反应）
LT007，慢病毒浓缩试剂盒（50 ml）
LT008，293Ta慢病毒颗粒包装细胞系(1.5 x 106 cells)。