Western Blot结果条带分析

westernblot条带分析

w e s t e r n b l o t条带分析(总6页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。

特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。

其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。

限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。

Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。

我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。

再无，则压过夜。

共3张片，根据每次结果调整。

其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。

这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。

然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。

取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。

在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。

荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。

现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注6高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- --精细操作*注13--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带 - - --- - ---使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

WB免疫印迹中常见问题和解决方法1电泳中常出现的一些现

WB免疫印迹中常见问题和解决方法1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

●拖尾原因：样品溶解不好。

●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。

●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

●条带两边扩散原因：加样量过多。

2．Western blot 结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。

●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。

●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。

●检测时曝光时间过长减少曝光时间。

3．Western blot 结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。

●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

●上样量过高，太敏感适当减少上样量。

●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。

●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。

4 . Western blot 结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

western-blot条带分析报告及解决方法

持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。

如果没有背景则就是原因3的现象。

在暗室可以看到文案大全条带周围荧光而条带处为暗。

如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。

也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。

还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。

其分析和解决同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。

如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。

如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。

但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。

但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。

原因1和3若如是则解决也是一样的。

*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。

主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。

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其中两张片子的压法如下描述:先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。

这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。

然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。

取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。

在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。

荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。

现象---------------------原因-------------------------------解决反影(白色条带,黑色背景)-------1HRP过高(背景较高)---------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色------2HRP过高(敏感性太高)--------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无-----------------3HRP过高引起底物迅速耗竭----------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3-------------------------4抗体-抗原系统敏感性过低----------提高抗体浓度/蛋白上样量*注4------------------------5转膜不充分/过转------------------优化转膜条件*注5------------------------6HRP或底物活性降低-----------------测试活性或选用敏感底物*注6高背景-------------------7HRP过高(背景较高)--------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7--------------------------8封闭时间不足------------------延长封闭时间4度过夜最好*注8-------------------------9抗体与封闭液有交叉---------------更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9------------------------10TBST洗脱不足------------------增加洗脱时间、次数、用量*注10-------------------------11暴光时间过长---------------------降低暴光时间*注11------------------------12抗原-抗体浓度过高--------------降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)----精细操作*注13-------------------------14膜平衡不均/油脂污染-----------按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14-----------------------------15膜与X光片间有气泡--------------显影前去除气泡*注15非特异性条带------------------16抗体交叉反应------------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16 -------------------------17SDS非特异性结合蛋白条带---------使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑-----------------18封闭液有杂质颗粒--------------------静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

Western blot 条带判定和图片处理标准流程

Western条带判定的标准流程
1、确认目的蛋白的理论分子量
2、通过Uniprot，确认蛋白是否有信号肽，酶切位点，异构体，糖基化修饰位点（一个糖
基化修饰能增加5KDa左右），磷酸化几乎不影响分子量大小。

3、进行肽链氨基酸的分子量判定：
计算出未修饰的全长肽链的分子量（uniport中的有），即理论分子量
计算分子中修饰基团的分子量。

目的蛋白实际分子量=异构体理论分子量-信号肽+糖基化位点数*5KDa，得到一个最大的分子量。

6、最后一步，将实验误差10%考虑进去，即得到一个蛋白的分子量对应的位置范围。

例如实际分子量为50kda，这目的蛋白实际分子量在45-55kda之间，均可接受。

7、最终每个指标的目的蛋白大小参考abcam、cst、novus、abcam4个公司做的实际分子量大小，如无较大出入则可，和别家公司有较大出入，则需进一步验证自己做出来的条带是否正确，通过阴性，阳性对照，KO实验，证明自己做的条带是真实的，即可上传官网。

1.在image lab中将原始图片调对比度，和亮度后，使图片背景干净，条带清晰，有微弱泳道痕迹即可，导出图片
2放入ppt中，剪切成大小合适，字体均用Arial 11号，黑色，短线均用0.6cm，黑色图片边框0.75磅，黑色，图片高度，宽度以目的条带为核心，上下无杂带尽量保留全maker。

3.图片另存为jep格式，A2016对应的货号为K0002354P,图片命名为K002354P-EIF5A-1/1000.。

western-blot条带分析及解决方法

持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。

如果没有背景则就是原因3的现象。

在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。

如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。

也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。

还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。

其分析和解决同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。

如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。

如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。

但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。

但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。

原因1和3若如是则解决也是一样的。

*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。

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westernblot曝光得到的图片，到底是要分析灰度值还是密度值？

westernblot曝光得到的图片，到底是要分析灰度值还是密度值？展开引用13579yyy1一般WB的分析都是测量积分光密度，也就是IOD。

这个值一般IOD=area xdensity(mean)......一、利用ImagJ对WB条带进行灰度分析1、File——》open 打开WB片子2、把图片转化成灰度图片 image——》type——》8-bit3、消除背景影响process——》subtract background 选择50基本可以4、设置定量参数analyze——》set measurements，点击面积，平均密度和灰度值及Integrated Density5、设置单位 analyze——》set scale ，在“unit of length”的方框里输入“pixels”6、把图片转换成亮带，Edit——》invert7、选择Freehand Selection，尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值8、复制数据IntDen进行分析二、利用ImagJ对WB条带进行密度分析1、File——》open 打开WB片子2、如条带不正，需修正image——》transform——》rotate 调节angle值，直到条带水平为止3、选中矩形选项，圈中第一个条带，然后 analyze——》gels——》select first lane（快捷键ctrl+1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，analyze——》gels——》select second lane （快捷键 ctrl+2），最后analyze——》gels——》plot lanes4、选中直线工具，将开口的波峰关闭5、选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值6、以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值为相对密度这是我在网上查到的，用ImagJ分析WB条带的方法到底要选第一种呢？还是第二种呢？。

Western Blot(WB)分析法

Western Blot（WB）分析法实验目的检测目的蛋白的表达情况。

实验原理Western Blot（WB）采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，例如硝酸纤维素薄膜（NC膜），固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤（一）蛋白胶的配制根据相关蛋白胶配制的说明书及目的蛋白的大小配制相适应浓度的分离胶和浓缩胶。

（二）跑胶浓缩胶的电压为80 V，分离胶的电压为120 V。

跑完胶后可根据原核或真核表达来选择是否进行染色，原核表达量高，可通过考马斯亮蓝染色观察表达情况，真核不易看出。

（三）转膜1. 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，本实验室采用电泳印迹法。

常用的电泳转移方法有湿转和半干转。

两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。

前者操作容易，转移效率高，但转移时间长；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。

2. 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western Blot成败的重要环节。

应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。

用于Western Blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。

NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下结合的蛋白还可以被洗脱下来。

根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC 膜。

因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。

Western blot结果异常原因分析及对策(个人总结)

⑷设置二抗对照(不加一抗),降低二抗
浓度
⑸一抗或二抗与封闭剂有交叉反应
⑸在孵育和洗涤液中加入Tween-20
以减少交叉反应.
⑹洗膜不充分
⑹增加洗涤次数及时间
⑺膜不合适
⑺NC 膜比 PVDF 膜背景低
⑻膜干燥
⑻保证充分反应液，避免出现干膜现象
⑼显色时间过长
⑼缩短显色时间
⑽膜没有均匀浸湿
⑽转膜前用 100%甲醇将膜完全浸湿
（无关蛋白中含有与待测抗原结构类似多肽（共或更换封闭剂（脱脂奶、BSA或明胶）
同抗原表位），与特异抗体发生交叉反应）
⑷一抗不识别目的物种的靶蛋白
⑷检查说明书，或做 ClustalW 比对，
设阳性对照
⑸样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过低
⑸模索条件，设置阳性对照，增加标本
（抗原无效）
上样量，样本制备时使用蛋白酶抑制剂,
或分级提取目的蛋白。
⑹转膜不充分,或洗膜过度
⑹使用丽春红 S 检膜。
⑺过度封闭
⑺使用含 0.5%脱脂奶或无脱脂奶抗体
稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间。
⑻一抗失效
⑻使用有效期内抗体,分装保存,避免反
复冻融取用, 工作液现配现用
⑼二抗受叠氮钠抑制
⑼溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP
Western blot 结果异常原因分析及对策（个人总结）
结果异常
原因
对策
1.假阴性，不出现 ⑴一抗、二抗等不匹配
⑴重新订购试剂，认真选取一抗与组织
蛋白条带或者蛋
种属，并设置内参。
白条带很弱
⑵一抗或/和二抗浓度低
⑵增加抗体浓度，延长孵育时间
⑶封闭剂或无关蛋白与一抗或二抗有交叉反应 ⑶封闭用温和去污剂，如TWEEN 20，

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。

下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。

实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。

2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。

3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。

通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。

注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。

使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。

2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。

同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。

3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。

转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。

4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。

需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。

5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。

Western-blot化学发光(ECL)出现非特异性条带,怎么办？(enlight)

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面：
1. 蛋白上样量过大。

可降低蛋白上样量。

2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。

可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩
短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。

3. 洗膜不充分。

可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终
浓度0.05%的Tween-20。

4. 目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等。

可查阅文献，用合适的方法去除蛋白的修饰，或选择合适的抗体。

5. 目的蛋白降解。

重新准备蛋白样品，并加入足够的蛋白酶抑制剂。

6. 发光液质量问题，可选用发光清晰的ECL发光液，如Enlight。

Fusion灰度分析半定量WesternBlot条带步骤

Fusion灰度分析半定量WesternBlot条带步骤Fusion灰度分析半定量Western Blot条带步骤1、打开图片
备注：此时可以调节图片灰度情况，但是对最终的结果影响不大
看到一下界面：
2、圈出要分析的条带
方法（1）整条一起圈出来，用于连续条带，条带位置差距不大，宽度差距不大的
方法（2）每个条带分别圈出来
3、下一步
4、去背景
5、下一步
出现一下界面：
6、分隔条带：对软件自动识别的条带进行修正，删除不必要的条带（Delete separation）或增加新的条带（Add separation）
7、指定作为100%参考量的参考条带
8、输出结果
9、结果分析
相对灰度计算：目的条带的Volume／内参的Volume
10、三次重复实验，归一
11、统计软件进行统计。

westernblot条带分析

近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。

特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。

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限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。

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共3张片，根据每次结果调整。

其中两张片子的压法如下描述：先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2 片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。

这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。

然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。

取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。

在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。

荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。

现象原因解决反影（白色条带,黑色背景） ----- 1 HRP 过高（背景较高） -----------------至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注1显影后膜上条带处变为黄色 ------ 2 HRP过高（敏感性太高） -------------至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注2 至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注7延长封闭时间4度过夜最好*注8信号弱或无 ------------------ 3 HRP -至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注3------------------------ 4--- 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4------------------------ 5---- 优化转膜条件*注5 ------------------------ 6 HRP-----* 6 过高引起底物迅速耗竭 ------------抗体-抗原系统敏感性过低 ---------- 转膜不充分/过转 --------------或底物活性降低 -------------------------------- 7 HRP过咼（背景较咼） --------------------------------- 8封闭时间不足 ---------------------------------------- 9——更换封闭液（如3%BS的TBST）*注9 ------------------------ 10 TBST----- 增加洗脱时间、次数、用量*注10 ------------------------ 11----降低暴光时间*注11------------------------ 12--- 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12抗体与封闭液有交叉 ------------洗脱不足-------------暴光时间过长 ----------------- 抗原-抗体浓度过高--------------条带内无显影的白点 ----------- 13转膜不良（如有气泡在胶-膜之间）---- 精细操作*注13 ------------------------ 14膜平衡不均/油脂污染 ------------ --- 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14非特异性条带 ------------------ 16 抗体交叉反应 ---------------------至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注16----------------------- 15----显影前去除气泡*注15 膜与X 光片间有气泡 -----------使用无SDS专膜液*注17散在小圆斑-- ----- ----- -----18 封闭液有杂质颗粒--- ----------------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1其具体问题有二：一是背景较高，二是没有条带•形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色，周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

Western Blot 结果条带全面分析

Western Blot 结果条带全面分析Q1. 啥也没有[原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。

[解决办法]：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。

[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。

如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。

另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。

Q2. 高背景[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够[解决办法]：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。

[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。

其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。

Q3. 非特异性条带[原因]：一抗非特异性与蛋白结合[解决办法]：更换一抗[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。

如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。

当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。

Q4. 条带中出现边缘规则的白圈[原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。

[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡[经验]：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。

western blot条带分析

近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。

特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。

其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。

限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。

Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。

我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。

再无，则压过夜。

共3张片，根据每次结果调整。

其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。

这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。

然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。

取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。

在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。

荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。

现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因- - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物*注6高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足- - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长- - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高- - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- -- 精细操作*注13 --- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带- - --- - ---使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑- - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

western-blot条带分析及解决方法模板

*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。

如果没有背景则就是原因3的现象。

在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。

如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。

也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。

还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。

其分析和解决同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。

如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。

如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。

但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。

但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。

原因1和3若如是则解决也是一样的。

*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。

Western Blot(个人版)分析

Western Blot 实验方法一蛋白提取1、切取组织，置于已经用记号笔标记好的EP管底，称重（mg）插入冰盒中，注意不同样品间所用剪刀、刀片、镊子等要擦拭干净。

2、配置裂解液：980ulRiPA+10ul10%PMSF+10ul混匀机混匀。

3、每EP管中加裂解液(10ul/1mg)，超声（time --pulse--AMPL- -start--O）5s停5s循环1min ,振幅25%（AMPL参数）,再裂解30min 。

4、于40C冷冻离心机中预冷15min，1200r/min.将裂解后的组织液离心15min，取上清即为所提蛋白，至于一个试管内，用酶标仪测浓度，再高温变性，再上样，多余的试剂置-80℃保存。

5、用玻璃小烧杯配制定量用的试剂：（2mlH2O+500ul考马斯亮蓝）+36ulH2O+4ul 样品，另加一个标准品BSA(10ul/ml)对照组，一个空白对照组。

6、(4倍)上样缓冲液稀释成（1倍），即:30ul上清液+10ul(4倍)上样缓冲液（红色的，购买的），震荡混合+离心，高温振荡机中变性，950C，5min，注意使离心液全部流于底部，准备跑电泳。

7、测595nm吸光度，打开盖预热30min，每次都将空白校正0，读取标准品对照组，样品组的吸光度，尽快。

比色皿水洗+酒精洗。

8、建Excel：（一）Cx=Ax/A标。

C标（C标=10ug/ml ,由30ul稀释至40ul, A标已经知道的）（二）一般上样量为：30ug, 故: 30ug上样量/(0.75Cx)=V上样（ml）由（一）（二），得：V上样=A标/Ax .4二配胶1、提前配板：洗板，吹干，对齐，夹紧（向下压），配分离胶（两块板10ml），灌胶，压水，观察是否漏液，出现分界面，配浓缩胶（两块板4ml），若温度太低不易凝，可将分离胶中10%APS,TEMED同时加倍促凝.将配胶用烧杯洗净干燥，配胶：10％分离胶5％浓缩胶10ml(两快板) 15ml(三快板) 4ml (l两块板) 6ml(三块板) H2O 4.0ml 5.9ml 2.7ml 4.1 ml 30％丙稀酰胺 3.3ml 5ml 670ul 1.0Tris-HCL 2.5ml（1.5M，Ph8.8）3.8ml 0.50ml（1.0M，Ph6.8）0.75ml 10％SDS 100μl 150ul 40μl60ul10％APS（聚合剂，现配，灌胶前加入）100μl 150ul 40μl60ul TEMED（加速剂，灌胶前加入）4μl 6ul 4μl6ul2、根据板子数计算所需胶的体积数，根据比例配制胶液，为铺胶平整下层胶铺好后立即UP水封，待胶干后倒去上层UP水并用滤纸吸干，按比例配制浓缩胶（积压胶），最后上梳子（注意孔数、厚度与玻璃板搭配）；补液。

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项西方博(Western blot) 是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质样品经过电泳分离并转移到膜上，再使用特异性抗体检测蛋白质的表达水平。

以下是西方博检测蛋白质表达实验的结论和注意事项。

结论：1. 蛋白质的分子量：西方博通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质的精确分子量。

根据蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以使用特定的分子量标准品绘制标准曲线，并在曲线上确定待测蛋白质的分子量。

2. 蛋白质的表达水平：西方博使用特异性抗体来检测特定蛋白质的表达水平。

利用特异性抗体与目标蛋白质的特定区域结合，然后使用辅助抗体标记抗体，并通过光学或化学方法检测抗体标记物的表达水平。

比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平可以确定其相对表达量。

注意事项：1. 样品的提取和准备：蛋白质的准备和提取是西方博实验的首要步骤。

样品应该被充分破碎，并使用适当的提取缓冲液来维持蛋白质的稳定性。

注意，使用不同类型的组织或细胞时，提取条件和方法可能有所不同。

2. 蛋白质的电泳分离：西方博通常使用SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 来进行蛋白质的分离。

凝胶的浓度和隔离电泳条件应选择适当，以分离不同分子量的蛋白质。

3. 转膜：将电泳分离的蛋白质转移到膜上是西方博的关键步骤之一。

选用合适的膜（如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素膜），并选择适当的电泳缓冲液进行转膜。

确保蛋白质能够均匀地转移到膜上。

4. 抗体的选择和试验条件：特异性抗体的选择和充分优化是确保实验准确性的关键因素。

保证抗体的特异性和亲和性，并验证抗体的工作浓度。

此外，充分优化抗体和探针的试验条件，包括反应温度、时间和抗体浓度等。

5. 成像和分析：西方博实验完成后，使用适当的成像方法（如化学发光或荧光成像）检测抗体标记物的表达水平。

使用适当的成像系统记录图像，确保信号处于线性范围内。

使用图像分析软件进行定量分析，比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平。

WesternBlot结果条带分析

Western Blot结果条带全面分析1.空白原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。

解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。

上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。

如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。

另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。

2.高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。

解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。

3.非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗4.条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。

解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡5.出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法：封闭结束之后要洗。

6.条带拖尾原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。

7.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。

8.某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。

另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。

9. 条带呈哑铃状原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用10.最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔其他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。

可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。

（2）蛋白质降解。

蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。

（3）所有条带连成一片没有间隔。

原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。

（4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。