免疫检测法ppt课件
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免疫检测法PPT课件
质。
缺点
01
02
03
04
交叉反应
有时会出现交叉反应，导致假 阳性结果。
抗体依赖
免疫检测法依赖于抗体的质量 和特异性，因此抗体制备的难
度和成本较高。
样品处理要求高
对于某些生物样品，需要进行 复杂的预处理才能进行检测。
检测时间较长
相对于一些快速检测方法，免 疫检测法可能需要更长时间才
能获得结果。
改进方向
分类
根据检测原理和应用领域，免疫 检测法可分为酶联免疫吸附试验 、放射免疫分析、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等。
免疫检测法的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测人体内的肿瘤标 志物、激素、病毒抗原、 药物残留等，辅助医生进 行疾病诊断和病情监测。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留、毒素等有 害物质，保障食品安全。
情监测。
激素水平检测
性激素检测
通过检测性激素水平，有助于评估男性和女性的生殖健康状况，如 睾酮、雌二醇、孕酮等激素的检测。
甲状腺激素检测
甲状腺激素对人体的新陈代谢和生长发育具有重要作用，通过检测 甲状腺激素水平，有助于甲状腺功能亢进和减退的诊断和治疗。
肾上腺激素检测
肾上腺激素与人体应激反应、免疫功能等方面密切相关，通过检测肾 上腺激素水平，有助于相关疾病的诊断和治疗。Fra bibliotek传染病检测
结核病检测
性病检测
通过检测结核病抗体，有助于早期发 现和诊断结核病，为预防和治疗提供 依据。
免疫检测法在性病检测中发挥着重要 作用，如梅毒、淋病、尖锐湿疣等， 通过检测相关抗体和抗原，及时发现 和治疗性病。
肝炎检测
缺点
01
02
03
04
交叉反应
有时会出现交叉反应，导致假 阳性结果。
抗体依赖
免疫检测法依赖于抗体的质量 和特异性，因此抗体制备的难
度和成本较高。
样品处理要求高
对于某些生物样品，需要进行 复杂的预处理才能进行检测。
检测时间较长
相对于一些快速检测方法，免 疫检测法可能需要更长时间才
能获得结果。
改进方向
分类
根据检测原理和应用领域，免疫 检测法可分为酶联免疫吸附试验 、放射免疫分析、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等。
免疫检测法的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测人体内的肿瘤标 志物、激素、病毒抗原、 药物残留等，辅助医生进 行疾病诊断和病情监测。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留、毒素等有 害物质，保障食品安全。
情监测。
激素水平检测
性激素检测
通过检测性激素水平，有助于评估男性和女性的生殖健康状况，如 睾酮、雌二醇、孕酮等激素的检测。
甲状腺激素检测
甲状腺激素对人体的新陈代谢和生长发育具有重要作用，通过检测 甲状腺激素水平，有助于甲状腺功能亢进和减退的诊断和治疗。
肾上腺激素检测
肾上腺激素与人体应激反应、免疫功能等方面密切相关，通过检测肾 上腺激素水平，有助于相关疾病的诊断和治疗。Fra bibliotek传染病检测
结核病检测
性病检测
通过检测结核病抗体，有助于早期发 现和诊断结核病，为预防和治疗提供 依据。
免疫检测法在性病检测中发挥着重要 作用，如梅毒、淋病、尖锐湿疣等， 通过检测相关抗体和抗原，及时发现 和治疗性病。
肝炎检测
单分子免疫检测 PPT
Simoa技术参数
反应体系：2.7 μm抗体包被磁珠+生物素化的检测抗体+链霉亲和素半乳糖甘酶
1个磁珠包被250000个捕获抗体，靶点分子极少的时候，1个磁珠仅补获1个蛋白分子
检测体系： 加入底物的磁珠转移到 Simoa 光盘上。 每个光盘有24个芯片（Array）， 每个芯片 有238000个直径为4.25 μm 的小孔，1个小孔仅能容纳一个磁珠 小孔体系仅有50 fL，在芯 片表面推一层油，一方面除去多余磁珠，另一方面将信号密 封在小孔中。 信号CCD 成像。
4、流式液相芯片：透镜生命和旷博生物
5、微流控技术：理邦血气、微点生物、天津微纳芯、博晖创新、博奥生物
6、光激发光化学发光技术：科美诊断、爱兴生物
7、质谱检测：迪安诊断、金域医学、安图生物
蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢 年均仅有1-2个新的生物标志物进入临床应用
现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展
SMC系统原理
SMC系统检测灵敏度
SMC系统检测灵敏度
单分子免疫检测技术发展瓶颈
（1）稳定性及效率 操作复杂，不稳定。 SiMoA检测时长1小时， SMC检测时长4小时。
（2）成本； 耗材昂贵。
（3）替代的必要性。 作为生物检测技术的极限尺子，单分子检测技术取代现有诊断技术成为市场的主流 是将来体外诊断市场发展的趋势。
2. Simoa可以通过加大稀释倍数，检测房水、玻璃体、眼泪等微量样品 中的炎症因子；
3. Simoa可以在单个细胞中定量蛋白，实现单个胚胎细胞培养上清中的 蛋白检测；
4. Simoa可以在外泌体等稀少样品类型中检测PD1、PD-L1等蛋白；
5. Simoa可以在阿尔兹海默症初期（提前16年），在接近正常人的患者 血清中检测到蛋白标志物NfL
免疫检测技术
基本步骤
原理
1
包被
洗涤
3 使结合在固相
上
的抗原抗体复 合物
2
反应
加入待测抗
体或
抗原和酶标 抗原
4
或抗体
底物显色
定性或定量的分 析
五种常见的检测方法
1 双抗夹心法（测定抗原） 2 测定抗体的间接法 3 竞争法（测定抗原） 4 捕获包被法测IgM抗体 5 ABS-ELISA法
1 双抗夹心法测抗原
适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗 原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心
3.免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。
免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、 火箭电泳、免疫印迹等
血清免疫电泳
将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳 分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入 抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示 病人血清与正常人血清存在的差异，即血清 蛋白组分的缺少或增加。
2 间接法测抗体
几种标记/检测技术灵敏度的比较
灵敏度(mol/L)
10-18 10-15 10-12 10-9
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测试剂的有效期比较
有效期（月）
18
15
12
9
6
3
酶标
荧光
放免
发光
人人民民币币
100,000 80,000 60,000 40,000 20,000 0
放免
三、补体结合实验 （2个系统，5种成分）
第十二章免疫检测原理及方法
第一页，共十五页。
第十二章 免疫检测原理(yuánlǐ)及 方法
免疫检测技术对于基础和临床兽医学发展以及在疾病诊断、 预防和治疗以及研究疾病起因、发生和发展的方面都有着极其 重要的意义。
免疫学技术的改进和发展，是建立在许多其他生物科学的 技术之上，如用生化和蛋白分离技术分离抗原和抗体、用分于 遗传学技术闸明免疫学上重要分子的基因序列。另一方面，免 疫学又形成了许多本学科的技术，尤其是依据于抗原-抗体反 应有高度(gāodù)特异性，作为检测手段胜过任何其他方法在这 方面的优势。
(hùnhé)，再使两者与定量的相应抗体(Ab)发生竞争性结合，也即 竞争抑制反应。
第八页，共十五页。
第二节 免疫细胞(xìbāo)的检测
参与免疫应答的细胞有多种，如负责体液免疫的B细胞， 执行细胞免疫的T细胞和沟通(gōutōng)体液免疫和细胞免疫的 其他细胞等。
T细胞、B细胞表面具有特异性抗原和多种受体，据此建立了 相应的检测方法，以鉴定和计数动物外周血液和淋巴样组织中的 T细胞、B细胞及其功能。
主要有两种方法：一是形态学检查法，即将加有PHA培 养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算 淋巴细胞转化率；另一种(yī zhǒnɡ)是同位素标记物掺入法， 即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，将具有放射性的 3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，被DNA的原料摄入转 化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲 数表示)，进而测定淋巴细胞的转化程度。
近年来，在上述基本反应基础上，采用荧光素、同位 素和酶标记技术，使抗原-抗体反应敏感度增加1,000倍以 上。这种免疫标记方法已广泛应用到医学、兽医学以及其 他生物学许多领域中。
第五页，共十五页。
二、抗原-抗体反应的基本(jīběn)类 型
第十二章 免疫检测原理(yuánlǐ)及 方法
免疫检测技术对于基础和临床兽医学发展以及在疾病诊断、 预防和治疗以及研究疾病起因、发生和发展的方面都有着极其 重要的意义。
免疫学技术的改进和发展，是建立在许多其他生物科学的 技术之上，如用生化和蛋白分离技术分离抗原和抗体、用分于 遗传学技术闸明免疫学上重要分子的基因序列。另一方面，免 疫学又形成了许多本学科的技术，尤其是依据于抗原-抗体反 应有高度(gāodù)特异性，作为检测手段胜过任何其他方法在这 方面的优势。
(hùnhé)，再使两者与定量的相应抗体(Ab)发生竞争性结合，也即 竞争抑制反应。
第八页，共十五页。
第二节 免疫细胞(xìbāo)的检测
参与免疫应答的细胞有多种，如负责体液免疫的B细胞， 执行细胞免疫的T细胞和沟通(gōutōng)体液免疫和细胞免疫的 其他细胞等。
T细胞、B细胞表面具有特异性抗原和多种受体，据此建立了 相应的检测方法，以鉴定和计数动物外周血液和淋巴样组织中的 T细胞、B细胞及其功能。
主要有两种方法：一是形态学检查法，即将加有PHA培 养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算 淋巴细胞转化率；另一种(yī zhǒnɡ)是同位素标记物掺入法， 即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，将具有放射性的 3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，被DNA的原料摄入转 化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲 数表示)，进而测定淋巴细胞的转化程度。
近年来，在上述基本反应基础上，采用荧光素、同位 素和酶标记技术，使抗原-抗体反应敏感度增加1,000倍以 上。这种免疫标记方法已广泛应用到医学、兽医学以及其 他生物学许多领域中。
第五页，共十五页。
二、抗原-抗体反应的基本(jīběn)类 型
临床免疫检验的质量保证PPT医学课件
Pm=
Pm<5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳 性标本在查清原因后重做。
根据二项式分布的概率计算
如果一个实验室检测HBsAg，平常病人结果的阳性率为 10%，即p=0.1, 在某一次检测19个样本出现5个阳性结果， 14个阴性结果，则检测过程中是否存在污染的可能性可通 过下述方法计算。即计算在19个样本中出现至少5个阳性结 果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4 个阳性结果的概率）即：
本章小结
分析前质量保证包括检验项目的申请、患者的准 备、标本的采集、运送、接收和保存等。
分析中的质量保证包括实验室环境条件、仪器设 备维护校准、试剂方法的性能验证、标准操作程序的 建立、人员培训、标本前处理、室内质量控制、室间 质量评价和实验室间比对等，其中室内质量控制和室 间质量评价是质量保证的重要方面。
本章小结
临床上绝大部分开展的免疫学检验，都是仅能作为 筛查试验或诊断试验，阳性结果仅代表在检测中发生了 抗原抗体的阳性反应，但阳性反应可能是真阳性，也可 能是假阳性，也就是说存在一定比例的假阳性可能。由 于免疫检验方法学的这一局限性，在免疫检验的分析前 、分析中和分析后质量保证中，都涉及到与其他检验项 目不同的特点，突出表现在检验项目的申请（分析前） 和结果的报告与解释（分析后）两个方面。
是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用 来决定实时的测定结果的可接受性。
通过参与EQA，实验室可对自己的实验操作进行纠正， 从而起到自我教育的作用。
第五节 分析后的质量保证
重点提示
结果的报告与解释 检验后标本的保存与处理 咨询服务
结果的报告
基本信息 ①患者的姓名、性别、年龄； ②送检科室或单位名称； ③标本采集时间和实验室接收标本时间；④标本的编号或 条码；⑤检测项目；⑥标本类型；⑦检测方法和主要设备 等。
Pm<5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳 性标本在查清原因后重做。
根据二项式分布的概率计算
如果一个实验室检测HBsAg，平常病人结果的阳性率为 10%，即p=0.1, 在某一次检测19个样本出现5个阳性结果， 14个阴性结果，则检测过程中是否存在污染的可能性可通 过下述方法计算。即计算在19个样本中出现至少5个阳性结 果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4 个阳性结果的概率）即：
本章小结
分析前质量保证包括检验项目的申请、患者的准 备、标本的采集、运送、接收和保存等。
分析中的质量保证包括实验室环境条件、仪器设 备维护校准、试剂方法的性能验证、标准操作程序的 建立、人员培训、标本前处理、室内质量控制、室间 质量评价和实验室间比对等，其中室内质量控制和室 间质量评价是质量保证的重要方面。
本章小结
临床上绝大部分开展的免疫学检验，都是仅能作为 筛查试验或诊断试验，阳性结果仅代表在检测中发生了 抗原抗体的阳性反应，但阳性反应可能是真阳性，也可 能是假阳性，也就是说存在一定比例的假阳性可能。由 于免疫检验方法学的这一局限性，在免疫检验的分析前 、分析中和分析后质量保证中，都涉及到与其他检验项 目不同的特点，突出表现在检验项目的申请（分析前） 和结果的报告与解释（分析后）两个方面。
是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用 来决定实时的测定结果的可接受性。
通过参与EQA，实验室可对自己的实验操作进行纠正， 从而起到自我教育的作用。
第五节 分析后的质量保证
重点提示
结果的报告与解释 检验后标本的保存与处理 咨询服务
结果的报告
基本信息 ①患者的姓名、性别、年龄； ②送检科室或单位名称； ③标本采集时间和实验室接收标本时间；④标本的编号或 条码；⑤检测项目；⑥标本类型；⑦检测方法和主要设备 等。
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20
• 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个 • • •
分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲 密结合。 生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。 可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子 形成生物素化的产物。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但 特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复 合体。 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大 21 大提高ELISA的敏感度。
9
10
• 待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其
一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端 与酶标记的特异性抗体结合。 • 此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子 抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。 不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单 价抗原的测定。
11
• 反应模式与双抗体夹心法类似。 • 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，
5
6
7
• ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的材料： • 1.固相的抗原或抗体 • 2.酶标记的抗原或抗体 • 3.酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性 状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类 型的检测方法。 • 4.相应的检测仪器.
8
1。夹心法 双抗体夹心法测抗原（常用） 双抗原夹心法测抗体 2。间接法测抗体（常用） 3。竞争法 竞争法测抗原 竞争法测抗体 4。捕获包被法测抗体 5。亲和素-生物素 ELISA法
意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。 若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影 响包被效果。
14
15
（1）将特异抗体与固相ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ体连接，形成固相抗 体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的 混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗 原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示 标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测 管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。
• 先将所有样品IgM（包括特异性IgM和非特
异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再 测定特异性IgM。
19
（1）将抗IgM抗体连接在固相载体上，形成固 相抗IgM，洗涤。 （2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的 IgM抗体被固相抗体捕获，洗涤。 （3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特 异性IgM结合，洗涤。 （4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在 固相上的抗原反应结合，洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本 中存在特异性IgM抗体，是为阳性反应。
以检测相应的抗体。 • 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测 定。 • 乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。 关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗 原。
12
13
• 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染
病的诊断。
• 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同
一酶标抗体检测相应抗体。
• 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注
16
◆如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与
固相抗体结合。
◆如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样
的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标 抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固 相载体的结合量减少。 固相抗体的结合最充分。
◆参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与
17
• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不
适用于
优点
注意
特异性高 不能检测小分子抗原及半抗原 双抗体夹心法测 是检测抗原最 3. 与固相抗原的竞争结合 抗原 常用的方法， 适用于检验各 取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液 100μl，加入 种蛋白质等大 酶标板的抗原孔中，放入 37℃恒温培养箱中60 min。洗 分子抗原
易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测 特异性抗体。
• 标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与
固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合 在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应 呈色浅于阴性反应。
18
• 样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异
性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测 定。因此测定IgM抗本多用捕获法。
1
50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫 （RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记 抗原或抗体的分析技术 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体 液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附 测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶 技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展 起来的一种免疫测定技术 。
3
• 免疫酶技术(enzyme immunoassay)：
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的 催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应 抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。
4
• ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 •
活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶 标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测 定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原 或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他 物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物 质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催 化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相 关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由 于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使 测定方法达到很高的敏感度。
2
• 免疫标记技术（immunolabelling
technique）: 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光 剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或 抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、 定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫 技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光 免疫测定
• 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个 • • •
分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲 密结合。 生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。 可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子 形成生物素化的产物。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但 特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复 合体。 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大 21 大提高ELISA的敏感度。
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• 待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其
一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端 与酶标记的特异性抗体结合。 • 此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子 抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。 不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单 价抗原的测定。
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• 反应模式与双抗体夹心法类似。 • 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，
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• ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的材料： • 1.固相的抗原或抗体 • 2.酶标记的抗原或抗体 • 3.酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性 状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类 型的检测方法。 • 4.相应的检测仪器.
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1。夹心法 双抗体夹心法测抗原（常用） 双抗原夹心法测抗体 2。间接法测抗体（常用） 3。竞争法 竞争法测抗原 竞争法测抗体 4。捕获包被法测抗体 5。亲和素-生物素 ELISA法
意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。 若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影 响包被效果。
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（1）将特异抗体与固相ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ体连接，形成固相抗 体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的 混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗 原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示 标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测 管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。
• 先将所有样品IgM（包括特异性IgM和非特
异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再 测定特异性IgM。
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（1）将抗IgM抗体连接在固相载体上，形成固 相抗IgM，洗涤。 （2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的 IgM抗体被固相抗体捕获，洗涤。 （3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特 异性IgM结合，洗涤。 （4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在 固相上的抗原反应结合，洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本 中存在特异性IgM抗体，是为阳性反应。
以检测相应的抗体。 • 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测 定。 • 乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。 关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗 原。
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• 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染
病的诊断。
• 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同
一酶标抗体检测相应抗体。
• 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注
16
◆如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与
固相抗体结合。
◆如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样
的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标 抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固 相载体的结合量减少。 固相抗体的结合最充分。
◆参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与
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• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不
适用于
优点
注意
特异性高 不能检测小分子抗原及半抗原 双抗体夹心法测 是检测抗原最 3. 与固相抗原的竞争结合 抗原 常用的方法， 适用于检验各 取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液 100μl，加入 种蛋白质等大 酶标板的抗原孔中，放入 37℃恒温培养箱中60 min。洗 分子抗原
易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测 特异性抗体。
• 标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与
固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合 在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应 呈色浅于阴性反应。
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• 样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异
性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测 定。因此测定IgM抗本多用捕获法。
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50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫 （RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记 抗原或抗体的分析技术 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体 液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附 测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶 技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展 起来的一种免疫测定技术 。
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• 免疫酶技术(enzyme immunoassay)：
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的 催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应 抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。
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• ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 •
活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶 标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测 定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原 或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他 物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物 质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催 化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相 关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由 于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使 测定方法达到很高的敏感度。
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• 免疫标记技术（immunolabelling
technique）: 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光 剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或 抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、 定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫 技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光 免疫测定