第5章 间接凝集反应技术

第五章间接凝集反应技术

(Indirect agglutination reaction technique)

一、概述

（一）原理

可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒（称为载体）表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。

载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。间接凝集反应的优点为：①敏感性强：间接凝集反应是最敏感性的血清学反应方法之一，可以检测到微量的抗体和抗原；②快速：一般1h～2h即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟；③特异性强；④使用方便、简单。

（二）载体

具有吸附抗原（或抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。

良好载体有如下几点基本要求：①在生理盐水或缓冲液无自凝倾向；②大小均匀；③比重与介质相似，短时间内不能沉淀；④无化学或血清学活性；⑤吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。

目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。而后者应用更广，因为其来源方便。另外绵羊红血球的表面有大量的（约1 000个以上）糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。

（三）间接凝集的分类

1．根据载体的不同，可分为间接炭凝、间接乳胶凝集和间接血凝等。

2．根据吸附物不同可分为间接凝集反应（吸附抗原）和反向间接凝集反应（吸附抗体）。

3．根据反应目的不同，又可分为间接凝集抑制反应和反向间接凝集抑制反应。

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4．根据用量和器材的不同又可分为试管法（全量法）、凹窝板法（半微量法）和反应板法（微量法）。

二、间接炭凝反应

（一）原理

间接炭凝集反应简称炭凝。它是以炭粉微粒作为载体，将已知的抗体球蛋白吸附于这种载体上，形成炭粉抗体复合物，当炭血清与相应的抗原相遇时，二者发生特异性结合，形成肉眼可见的炭微粒凝集块。

目前炭凝反应已用于炭疽、鼠疫和马副伤寒性流产等病的诊断。

（二）材料与试剂

1．炭粉炭粉粒子最好大小在0.12mm～0.15mm，目前市场上出售的炭粉均不合要求，必须过300目／寸的标准筛以300r／min离心去沉淀，再以3 000r／min 离心去上清，收集沉淀物。

2．高免血清

3．待测标本

4．灭活兔血清

5．正常血清

6．标准抗原

7．0.05mol/L pH7.2PBS液

8．1％硼酸的PBS液

（三）操作方法

1．炭致敏取湿炭粉0.25g（干粉0.10g），加入经56℃～60℃灭活30min的稀释高免血清3ml，充分摇匀，置37℃致敏30min，不时摇动，取出后用pH 7.2 PBS 液洗涤3次。最后一次用含1％硼酸和1％兔血清的PBS液洗涤一次，离心去上清，再取此液3ml，混匀即可。同时以正常血清致敏的炭粒处理，以作对照。

致敏血清（加1/万硫柳汞防腐）于室温或4℃冰箱中保存，一年内有效。

2．取洁净玻璃板一块，以玻璃铅笔划成小格，加被检标本0.10ml，再加免疫炭血清0.05ml，充分混匀，静止1min~5min，判定结果。同时设三个对照：

⑴免疫炭血清+标准抗原。

⑵正常炭血清+标准抗原。

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⑶正常炭血清加待检抗原。

（四）结果判定

在对照完全成立的情况下，判定本试验结果：

“＋＋＋＋”：炭粉全部凝集，液体完全清亮透明。

“＋＋＋”：炭粉大部分凝集，液体透明。

“＋＋”：炭粉一半凝集，液体较透明。

“＋”：炭粉微凝集，但与对照有差别，液体混浊。

“—”：炭粉不凝集，液体不透明。

炭凝以“＋＋”做为反应滴度的终点。

三、反向间接乳胶凝集反应

（一）原理

同炭凝，只是载体换为聚苯乙烯乳胶，它是一种由0.6μm～0.7μm的颗粒所组成的胶体溶液，具有良好的吸附蛋白质的性能。

间接乳胶凝集目前已用于鼠疫菌、沙门氏菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌、葡萄球菌肠毒素等的诊断。

（二）材料与试剂

1．聚苯乙烯乳胶

2．免疫血清

3．正常血清

4．标准抗原

5．待检抗原

6．0.02Mol/L pH8.2硼酸缓冲液

硼砂 6.67g

硼酸8.04g

H2O 加至 1 000ml

7．生理盐水

（三）操作方法

1．乳胶液制备取聚苯乙烯乳胶0.10ml，加灭菌蒸馏水0.40ml，再加pH8.2硼酸缓冲液2ml，混合后即为25倍稀释的乳胶液。

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2．乳胶致敏在上述乳胶液中滴加稀释的免疫血清0.20ml～0.70ml，边加边摇，当出现肉眼可见的颗粒后，仍继续加血清，直至颗粒消失，成为均匀的乳胶悬液为止。镜下检查应无自凝。使用时，应与一定稀释度的相应抗原出现阳性反应，与生理盐水出现阴性反应为合格。加防腐剂后，于冰箱内保存。注意防止冰冻。

同时以正常血清代替免疫血清进行乳胶致敏，以作对照。

3．取洁净玻板一块，用玻璃铅笔划成小格，滴加待检样品0.10ml，再滴加高免血清致敏乳胶0.01ml，以牙签或火柴杆混匀，在3min内判定结果。

（四）结果判定

“＋＋＋＋”：全部乳胶凝集，成絮状团块，液体清亮。

“＋＋＋”：大部分乳胶凝集成较小的颗粒，液体清亮。

“＋＋”：半量乳胶凝集成细小颗粒，液体混浊。

“＋”：较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒，液体混浊。

“－”：全部乳胶仍为均匀液体，无颗粒。

以“＋＋”作为该反应滴度的终点。

四、间接红血球凝集反应

间接红血球凝集反应（简称间接血凝）是间接凝集反应中应用最广的一种方法。

（一）原理

以红血球为载体的间接凝集反应叫做间接血凝。将抗原吸附在红血球上用以检测微量抗体称为正向间接血凝，以抗体吸附于红血球上，检测相应的抗原，称为反向间接血凝。

用抗原吸附红血球，一般比较容易，但用免疫血清吸附红血球，则困难得多，而且往往不易获得良好的结果，因为免疫血清中的成分非常复杂。许多其他蛋白质和非抗体活性的免疫球蛋白占据红血球的表面，而影响血球的特异性凝集。

（二）材料与试剂

1．红血球

2．反应板分聚苯乙烯塑料板和有机玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔两种规格。按孔型又可分为V和U型两种，V型具有更典型的凝集模型，U型有时比V型的血清效价高1～2孔。反应板不能煮沸消毒和浸泡于来苏儿水中。消毒可用0.5％甲醛溶液，1％新洁尔灭及紫外线照射等。

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