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15
噬菌体展示肽库构建原理图
合成随机片段 PCR扩增
目的片段
载体噬菌体 RF DNA或噬菌粒 酶切
连接
插入外源基因的噬菌体DNA
或噬菌粒DNA
多次电转化大肠杆菌
转化菌
培养产生病毒子
辅助噬菌体侵染
噬菌粒肽库
肽库
16
天然抗体库和抗体的获得
从未经免疫的动物或人外周血淋巴细胞、 骨髓细胞、脾细胞获得B淋巴细胞，减少 因抗原刺激所引起的B细胞谱的变化。
抗体库
.
1
单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑， 在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯等方面显示 出重要作用和广阔的应用前景。然而在体内的 应用，由于是异源性蛋白易引起人抗小鼠抗体 反应，影响应有的疗效。
2
在小鼠杂交瘤技术建立不久，就开始了人杂交 瘤技术的研究，但历经20多年这项技术尚未获 得真正的突破，其主要原因有：
4
eg.将鼠源性单抗可变区与人恒定区基因拼接起 来形成的嵌合抗体；
通过置换人源单抗中的CDR区的改形抗体 以连接肽将VH和VL连接起来的单链抗体
5
抗体库特别是噬菌体展示技术的创建，被誉为 又一次革命性进展。由于目前大部分基因工程 抗体还是基于小鼠杂交瘤，鼠源蛋白的问题尚 未彻底解决。抗体库技术用细菌克隆取代B细 胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免 疫，针对制备任何抗原的单克隆抗体。它为人 单抗的制备提供了一条非常有效的方法，基因 工程抗体的进展已使抗体的制备和应用进入了 又一个全新的时代。
生物淘筛示意图 13
来自百度文库
噬菌体展示的重要意义在于： 1.被选择的多肽展示在噬菌体表面，在获得多
肽的同时也得到了编码该多肽的基因序列； 2.亲和选择可以得到亲和力强的重组噬菌体，
整个过程与动物体内抗原对抗体克隆选择原理 相同。
14
噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗 体库构建和单克隆抗体的筛选。将抗体分子片 段与噬菌体外壳蛋白Ⅲ融合，使之表达于噬菌 体颗粒的表面，这就形成了噬菌体抗体。将全 套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来， 组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒 表面，则得到噬菌体抗体库。它可以使人们在 体外模拟体内抗体产生过程，制备出针对任何 抗原的单克隆抗体。
17
从这些细胞中提取RNA，反转录成cDNA，用 与抗体VH、VL支架序列FR1、FR4互补的寡 核苷酸为引物，以PCR方法获得V基因，克隆 到噬菌体或噬菌粒载体中表达并展示，这种噬 菌体抗体库称为天然抗体库。
18
天然噬菌体抗体库的主要优点：
1.建一个抗体库，可用于多种不同抗原 2.可得到人源抗体 3.可得到针对自身抗原、非免疫原性的或毒性
12
Eluted pool of phage is amplified, and the process is repeated for a total of 3-4 rounds.
After 3-4 rounds, individual clones isolated and sequenced.
6
噬菌体展示技术的形成： 1982年，Dulbecco首次提出源于致病因子的具有免疫
原性的外源抗原决定簇或多肽可以在噬菌体或其它病 毒表面被展示的概念。 1985年，Smith第一次证实丝状噬菌体fd的基因组能够 通过基因工程手段将外源抗原决定簇与其次要外壳蛋 白融合并同时展示在噬菌体表面。 1990年，Smith小组又证明展示的抗原决定簇能被相应 的抗体所识别，从而创建了噬菌体展示技术。
1.难于获得稳定分泌人抗体的杂交瘤细胞。 2.难于获得分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞。 人源抗体的生产在技术上难以克服融合率低、
建株难、不稳定、产量低，人体不能随意免疫 等问题。
3
随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学 的深入研究，应用基因工程技术改造现有优良 的鼠单抗的基因，其着手点在于尽量减少抗体 中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异 性，从而创造出新型抗体——基因工程抗体。
11
先将选择体固相化，然后使文库中重组噬菌体 所展示的目的多肽与固相化选择体亲和结合， 通过洗脱就可以收集到带有目的多肽或蛋白的 重组噬菌体，并可利用噬菌体再感染大肠杆菌 得以进一步扩增。通过一轮亲和结合—洗脱— 扩增，即所谓淘筛的过程，可以使噬菌体富集 约100~1000倍，经过几轮淘筛可以从噬菌体文 库中筛选到带有目的基因的重组噬菌体。
20
合成抗体库和抗体的获得
随着人们对机体内抗体产生过程中DNA重排复 杂过程的清楚认识，以及对许多抗体结构的研 究，业已证明大多数抗体的抗原结合位点位于 互补决定区内。这为完全脱离自然个体构建抗 体分子奠定了基础。
物质的抗体 4.抗体产生用2~4轮筛选，仅需两周左右的时间 5.当抗体库容量很大时，可得到高亲和力抗体
19
天然噬菌体抗体库的主要不足：
1.抗体库库容量小时，得到的抗体亲和力较低 2.建库费时、费力 3.所谓“天然”并非真正完全天然，受个体发
育限制如对自身反应性克隆的抑制或对自身抗 原的免疫耐受、B细胞供者的不明确免疫史、 激活的B细胞及浆细胞可能存在，它们的抗体 可变区基因已经历了超突变，影响了B细胞的 多样性。
9
噬菌体展示技术是将目的基因与编码噬菌体外 壳蛋白基因相连，并插入到噬菌体表达载体， 使多肽或蛋白与其外壳蛋白氨基端融合并展示 在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相 对独立的空间结构和生物活性。
10
从表达各种各样外源蛋白的噬菌体群体（库） 中筛选出带有特异外源蛋白的重组噬菌体，一 般采用亲和筛选，即利用在噬菌体表面上展示 的多肽可以与特定的选择体进行亲和结合，从 而得以分离。
7
丝状噬菌体的生物学特征：
丝状噬菌体主要包括大肠杆菌丝状噬菌体M13、 fd、f1等，它们的亲缘关系十分密切，特征相 似，都包含一个单链环状DNA分子，DNA同 源性高达98%。这种噬菌体只能通过大肠杆菌 的性菌毛才能将其DNA注入细菌，因此它只侵 染含F因子的雄性大肠杆菌。
8
外源多肽或蛋白在丝状噬菌体外壳蛋白上的展示
噬菌体展示肽库构建原理图
合成随机片段 PCR扩增
目的片段
载体噬菌体 RF DNA或噬菌粒 酶切
连接
插入外源基因的噬菌体DNA
或噬菌粒DNA
多次电转化大肠杆菌
转化菌
培养产生病毒子
辅助噬菌体侵染
噬菌粒肽库
肽库
16
天然抗体库和抗体的获得
从未经免疫的动物或人外周血淋巴细胞、 骨髓细胞、脾细胞获得B淋巴细胞，减少 因抗原刺激所引起的B细胞谱的变化。
抗体库
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1
单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑， 在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯等方面显示 出重要作用和广阔的应用前景。然而在体内的 应用，由于是异源性蛋白易引起人抗小鼠抗体 反应，影响应有的疗效。
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在小鼠杂交瘤技术建立不久，就开始了人杂交 瘤技术的研究，但历经20多年这项技术尚未获 得真正的突破，其主要原因有：
4
eg.将鼠源性单抗可变区与人恒定区基因拼接起 来形成的嵌合抗体；
通过置换人源单抗中的CDR区的改形抗体 以连接肽将VH和VL连接起来的单链抗体
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抗体库特别是噬菌体展示技术的创建，被誉为 又一次革命性进展。由于目前大部分基因工程 抗体还是基于小鼠杂交瘤，鼠源蛋白的问题尚 未彻底解决。抗体库技术用细菌克隆取代B细 胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免 疫，针对制备任何抗原的单克隆抗体。它为人 单抗的制备提供了一条非常有效的方法，基因 工程抗体的进展已使抗体的制备和应用进入了 又一个全新的时代。
生物淘筛示意图 13
来自百度文库
噬菌体展示的重要意义在于： 1.被选择的多肽展示在噬菌体表面，在获得多
肽的同时也得到了编码该多肽的基因序列； 2.亲和选择可以得到亲和力强的重组噬菌体，
整个过程与动物体内抗原对抗体克隆选择原理 相同。
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噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗 体库构建和单克隆抗体的筛选。将抗体分子片 段与噬菌体外壳蛋白Ⅲ融合，使之表达于噬菌 体颗粒的表面，这就形成了噬菌体抗体。将全 套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来， 组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒 表面，则得到噬菌体抗体库。它可以使人们在 体外模拟体内抗体产生过程，制备出针对任何 抗原的单克隆抗体。
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从这些细胞中提取RNA，反转录成cDNA，用 与抗体VH、VL支架序列FR1、FR4互补的寡 核苷酸为引物，以PCR方法获得V基因，克隆 到噬菌体或噬菌粒载体中表达并展示，这种噬 菌体抗体库称为天然抗体库。
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天然噬菌体抗体库的主要优点：
1.建一个抗体库，可用于多种不同抗原 2.可得到人源抗体 3.可得到针对自身抗原、非免疫原性的或毒性
12
Eluted pool of phage is amplified, and the process is repeated for a total of 3-4 rounds.
After 3-4 rounds, individual clones isolated and sequenced.
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噬菌体展示技术的形成： 1982年，Dulbecco首次提出源于致病因子的具有免疫
原性的外源抗原决定簇或多肽可以在噬菌体或其它病 毒表面被展示的概念。 1985年，Smith第一次证实丝状噬菌体fd的基因组能够 通过基因工程手段将外源抗原决定簇与其次要外壳蛋 白融合并同时展示在噬菌体表面。 1990年，Smith小组又证明展示的抗原决定簇能被相应 的抗体所识别，从而创建了噬菌体展示技术。
1.难于获得稳定分泌人抗体的杂交瘤细胞。 2.难于获得分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞。 人源抗体的生产在技术上难以克服融合率低、
建株难、不稳定、产量低，人体不能随意免疫 等问题。
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随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学 的深入研究，应用基因工程技术改造现有优良 的鼠单抗的基因，其着手点在于尽量减少抗体 中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异 性，从而创造出新型抗体——基因工程抗体。
11
先将选择体固相化，然后使文库中重组噬菌体 所展示的目的多肽与固相化选择体亲和结合， 通过洗脱就可以收集到带有目的多肽或蛋白的 重组噬菌体，并可利用噬菌体再感染大肠杆菌 得以进一步扩增。通过一轮亲和结合—洗脱— 扩增，即所谓淘筛的过程，可以使噬菌体富集 约100~1000倍，经过几轮淘筛可以从噬菌体文 库中筛选到带有目的基因的重组噬菌体。
20
合成抗体库和抗体的获得
随着人们对机体内抗体产生过程中DNA重排复 杂过程的清楚认识，以及对许多抗体结构的研 究，业已证明大多数抗体的抗原结合位点位于 互补决定区内。这为完全脱离自然个体构建抗 体分子奠定了基础。
物质的抗体 4.抗体产生用2~4轮筛选，仅需两周左右的时间 5.当抗体库容量很大时，可得到高亲和力抗体
19
天然噬菌体抗体库的主要不足：
1.抗体库库容量小时，得到的抗体亲和力较低 2.建库费时、费力 3.所谓“天然”并非真正完全天然，受个体发
育限制如对自身反应性克隆的抑制或对自身抗 原的免疫耐受、B细胞供者的不明确免疫史、 激活的B细胞及浆细胞可能存在，它们的抗体 可变区基因已经历了超突变，影响了B细胞的 多样性。
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噬菌体展示技术是将目的基因与编码噬菌体外 壳蛋白基因相连，并插入到噬菌体表达载体， 使多肽或蛋白与其外壳蛋白氨基端融合并展示 在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相 对独立的空间结构和生物活性。
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从表达各种各样外源蛋白的噬菌体群体（库） 中筛选出带有特异外源蛋白的重组噬菌体，一 般采用亲和筛选，即利用在噬菌体表面上展示 的多肽可以与特定的选择体进行亲和结合，从 而得以分离。
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丝状噬菌体的生物学特征：
丝状噬菌体主要包括大肠杆菌丝状噬菌体M13、 fd、f1等，它们的亲缘关系十分密切，特征相 似，都包含一个单链环状DNA分子，DNA同 源性高达98%。这种噬菌体只能通过大肠杆菌 的性菌毛才能将其DNA注入细菌，因此它只侵 染含F因子的雄性大肠杆菌。
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外源多肽或蛋白在丝状噬菌体外壳蛋白上的展示