抗体库ppt课件

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合成抗体库和抗体的获得
随着人们对机体内抗体产生过程中DNA重排复 杂过程的清楚认识，以及对许多抗体结构的研 究，业已证明大多数抗体的抗原结合位点位于 互补决定区内。这为完全脱离自然个体构建抗 体分子奠定了基础。
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Eluted pool of phage is amplified, and the process is repeated for a total of 3-4 rounds.
After 3-4 rounds, individual clones isolated and sequenced.
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噬菌体展示肽库构建原理图
合成随机片段 PCR扩增
目的片段
载体噬菌体 RF DNA或噬菌粒 酶切
连接
插入外源基因的噬菌体DNA
或噬菌粒DNA
多次电转化大肠杆菌
转化菌
培养产生病毒子
辅助噬菌体侵染
噬菌粒肽库
肽库
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天然抗体库和抗体的获得
从未经免疫的动物或人外周血淋巴细胞、 骨髓细胞、脾细胞获得B淋巴细胞，减少 因抗原刺激所引起的B细胞谱的变化。
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噬菌体展示技术的形成： 1982年，Dulbecco首次提出源于致病因子的具有免疫
原性的外源抗原决定簇或多肽可以在噬菌体或其它病 毒表面被展示的概念。 1985年，Smith第一次证实丝状噬菌体fd的基因组能够 通过基因工程手段将外源抗原决定簇与其次要外壳蛋 白融合并同时展示在噬菌体表面。 1990年，Smith小组又证明展示的抗原决定簇能被相应 的抗体所识别，从而创建了噬菌体展示技术。
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eg.将鼠源性单抗可变区与人恒定区基因拼接起 来形成的嵌合抗体；
通过置换人源单抗中的CDR区的改形抗体 以连接肽将VH和VL连接起来的单链抗体
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抗体库特别是噬菌体展示技术的创建，被誉为 又一次革命性进展。由于目前大部分基因工程 抗体还是基于小鼠杂交瘤，鼠源蛋白的问题尚 未彻底解决。抗体库技术用细菌克隆取代B细 胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免 疫，针对制备任何抗原的单克隆抗体。它为人 单抗的制备提供了一条非常有效的方法，基因 工程抗体的进展已使抗体的制备和应用进入了 又一个全新的时代。
物质的抗体 4.抗体产生用2~4轮筛选，仅需两周左右的时间 5.当抗体库容量很大时，可得到高亲和力抗体
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天然噬菌体抗体库的主要不足：
1.抗体库库容量小时，得到的抗体亲和力较低 2.建库费时、费力 3.所谓“天然”并非真正完全天然，受个体发
育限制如对自身反应性克隆的抑制或对自身抗 原的免疫耐受、B细胞供者的不明确免疫史、 激活的B细胞及浆细胞可能存在，它们的抗体 可变区基因已经历了超突变，影响了B细胞的 多样性。
抗体库
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单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑， 在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯等方面显示 出重要作用和广阔的应用前景。然而在体内的 应用，由于是异源性蛋白易引起人抗小鼠抗体 反应，影响应有的疗效。
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在小鼠杂交瘤技术建立不久，就开始了人杂交 瘤技术的研究，但历经20多年这项技术尚未获 得真正的突破，其主要原因有：
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从这些细胞中提取RNA，反转录成cDNA，用 与抗体VH、VL支架序列FR1、FR4互补的寡 核苷酸为引物，以PCR方法获得V基因，克隆 到噬菌体或噬菌粒载体中表达并展示，这种噬 菌体抗体库称为天然抗体库。
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天然噬菌体抗体库的主要优点：
1.建一个抗体库，可用于多种不同抗原 2.可得到人源抗体 3.可得到针对自身抗原、非免疫原性的或毒性
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丝状噬菌体的生物学特征：
丝状噬菌体主要包括大肠杆菌丝状噬菌体M13、 fd、f1等，它们的亲缘关系十分密切，特征相 似，都包含一个单链环状DNA分子，DNA同 源性高达98%。这种噬菌体只能通过大肠杆菌 的性菌毛才能将其DNA注入细菌，因此它只侵 染含F因子的雄性大肠杆菌。
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外源多肽或蛋白在丝状噬菌体外壳蛋白上的展示
生物淘筛示意图 13
噬菌体展示的重要意义在于： 1.被选择的多肽展示在噬菌体表面，在获得多
肽的同时也得到了编码该多肽的基因序列； 2.亲和选择可以抗体克隆选择原理 相同。
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噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗 体库构建和单克隆抗体的筛选。将抗体分子片 段与噬菌体外壳蛋白Ⅲ融合，使之表达于噬菌 体颗粒的表面，这就形成了噬菌体抗体。将全 套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来， 组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒 表面，则得到噬菌体抗体库。它可以使人们在 体外模拟体内抗体产生过程，制备出针对任何 抗原的单克隆抗体。
11 先将选择体固相化，然后使中重组噬菌体 所展示的目的多肽与固相化选择体亲和结合， 通过洗脱就可以收集到带有目的多肽或蛋白的 重组噬菌体，并可利用噬菌体再感染大肠杆菌 得以进一步扩增。通过一轮亲和结合—洗脱— 扩增，即所谓淘筛的过程，可以使噬菌体富集 约100~1000倍，经过几轮淘筛可以从噬菌体文 库中筛选到带有目的基因的重组噬菌体。
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噬菌体展示技术是将目的基因与编码噬菌体外 壳蛋白基因相连，并插入到噬菌体表达载体， 使多肽或蛋白与其外壳蛋白氨基端融合并展示 在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相 对独立的空间结构和生物活性。
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从表达各种各样外源蛋白的噬菌体群体（库） 中筛选出带有特异外源蛋白的重组噬菌体，一 般采用亲和筛选，即利用在噬菌体表面上展示 的多肽可以与特定的选择体进行亲和结合，从 而得以分离。
1.难于获得稳定分泌人抗体的杂交瘤细胞。 2.难于获得分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞。 人源抗体的生产在技术上难以克服融合率低、
建株难、不稳定、产量低，人体不能随意免疫 等问题。
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随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学 的深入研究，应用基因工程技术改造现有优良 的鼠单抗的基因，其着手点在于尽量减少抗体 中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异 性，从而创造出新型抗体——基因工程抗体。