膜片钳技术在药学研究中的应用

膜片钳技术在药学研究中的应用前言德国物理学家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片钳技术（patch clamp technique）是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多数的）离子通道活动的技术，已被广泛应用。

作为先进的细胞电生理技术，它一直被奉为研究离子通道的“金标准”。

应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。

基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。

关键词膜片钳技术；药学研究；应用Abstract [ ]The patch-clamp technique , a dominant technique in cellular electrophysiology , is always being regarded as the gold standard for ion channel research.. Application of the patch-clamp technique can demonstrate the existences of ion channels and provide valuable information for ion channels, including their electrophysiological properties , molecular structures and the mechanism of drug action .Genomics and proteomics research has showed that the development of drugs for ion channel target would be very promising in future.Key words Patch-clamp technique ; Study on Medicinal chemistry ; Application80年代初发展起来的膜片钳技术（patch clamp technique）为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段，该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其它生物现象有更进一步的了解，而且基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。

为了突破由于筛选技术所造成的对离子通道为靶标的药物开发的瓶颈，近年来，对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的要求，由此产生了一些技术。

一、膜片钳技术原理及特点膜片钳技术通过玻璃微电极与细胞膜形成高阻封接，可以测到1pA的电流灵敏度，1㎜空间分辨力及10ms时间分辨力，为从分子水平了解生物膜离子通道的开启和关闭、动力学、选择性和通透性等膜信息，提供了直接手段。

膜片钳技术对膜电压的钳制是通过负反馈回路而实现的。

这种负反馈电路要求细胞膜电位在所有时间都与经放大器输出的指令电压相等。

当由于离子通道的开放造成膜电位与指令电位之间发生差异时，微电极放大器就通过记录电极向胞内自动注入大小相等和方向相反的电流而使膜电位得以钳制。

通过记录放大器用以维持细胞膜钳制电位所输出的电流大小，即可推算出由于离子通道开放所产生的电流的大小，以及由此导致的膜电导的改变。

膜片钳技术有不同的记录方法，如细胞贴附式、全细胞式、内面向外式、外面向内式等。

根据研究目的和观察内容的不同，可采取相应的记录方法。

此外，还有穿孔膜片钳记录、带核膜片记录、人工脂膜的膜电流记录等其它记录方式。

表1 膜片钳记录模式[5.6]记录模式形成方式优点缺点常规全细胞记录模式形成高阻封接后，向毛细管内施加负压吸破细胞膜，即形成全细胞记录模式串联电阻小，细胞不容易受损而死，可对许多常规微电极不能研究的小细胞进行研究，实验中有好的信噪比；可以控制细胞外成分就某种离子进行针对性研究，可在电流钳下做动作电位。

细胞内可流动的小分子能渗漏到电极液中，被电流迅速失活细胞贴附式将微吸管吸附于膜表面，形成高阻封接即可直接施加负压对膜片进行电压钳制，可以在保持细胞内正常环境时对离子通道的活性进行观察监测不能人为控制细胞内环境，不能准确测量胞内电压，外液中加入的刺激剂无法到达与电极内液接触的细胞外表面膜内面向形成全细胞模式后，将微吸管提起使膜可直接且自由地经外液介导而调节细胞内液环境，并可在和细胞活动因有细胞质渗漏可能会出现下落迹象外式片与细胞体分离，尖端形成的小泡几秒后破裂即形成此模式无关的条件下记录到单一离子通道的活动膜外面向外式形成全细胞模式后，将微吸管提起使膜片与细胞体分离，膜片自然封合，即可形成。

可在自由改变细胞外液环境的情况下，记录单一离子通道的电流活动有可能丢失细胞质因子开放细胞吸附膜内面向外式形成高阻封接后，对吸附膜片外的其它部分进行机械破坏即可经破坏孔调节细胞内液成分，来记录单通道电流信号，如果细胞体积越大，破坏孔离吸附膜片越远或破坏孔越小，则越可能使细胞质因子外流变慢对细胞有机械损伤穿孔囊泡膜外面向外式形成穿孔膜片模式后，提起微吸管便在管尖端处形成一个膜囊泡如果形成的模式好，此膜囊泡内不仅有细胞质因子还可能有线粒体等细胞器存在，可以在比较接近正常细胞内信号传递条件和代谢条件的基础上，记录到单一离子通道电流只能进行一价离子电流的测定二、膜片钳技术的应用膜片钳技术自从发明以来，被广泛用于生物学、生理学、生物化学、药理学、药学等多种学科的基础研究和应用研究中，并与其他许多技术进行了有机结合，为解决生物学跨膜信号传导问题提供了革命性的手段。

1.膜片钳技术在通道研究中的重要作用应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型，并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。

同时用于研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。

结合分子克隆和定点突变技术，膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。

另外，利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。

如神经元烟碱受体为配体门控性离子通道，膜片钳全细胞记录技术通过记录烟碱诱发电流，可直观地反映出神经元烟碱受体活动的全过程，包括受体与其激动剂和拮抗剂的亲和力，离子通道开放、关闭的动力学特征及受体的失敏等活动。

使用膜片钳全细胞记录技术观察拮抗剂对烟碱受体激动剂量效曲线的影响，来确定其作用的动力学特征。

然后根据分析拮抗剂对受体失敏的影响，拮抗剂的作用是否有电压依赖性、使用依赖性等特点，可从功能上区分拮抗剂在烟碱受体上的不同作用位点，即判断拮抗剂是作用在受体的激动剂识别位点，离子通道抑或是其它的变构位点上。

2.与药物作用有关的心肌离子通道心肌细胞通过各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的维持而保持正常的功能。

近年来，国外学者在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了许多进展，使得心肌药理学实验由动物细胞模型向人心肌细胞成为可能。

目前利用膜片钳技术的实验研究所涉及的主要离子通道有以下四种：2.1快钠通道能够去极化心肌细胞，传播动作电位，对维持细胞兴奋性及正常生理功能有重要作用。

另外，钠通道具有其选择性拮抗剂河豚毒及局麻药和Ⅰ性抗心律失常药的结合位点。

Feng等用全细胞记录法证实急性分离和培养的人心房细胞钠通道主要参数无明显差别。

而心外膜下与心内膜下钠通道的阻断作用延长动作电位计不应期而减轻或逆转实行心律失常。

2.2钙通道心肌的兴奋与收缩和心肌细胞钙离子通道密切相关。

目前膜片钳技术已在心肌细胞上记录到L、T和B型电压依赖性钙通道。

L型钙通道目前研究最多，心肌以持久开放、失活缓慢的L型占优势，具有电压、时间依赖性。

2.3钾通道种类最多，作为一大类通过调节膜电位而降低组织兴奋性，通过阻抗去极化影响动作电位的频率及动作时程，因而能够在不同的时程和电位水平精确调控细胞静息膜电位和动作电位。

目前已经能够根据不同的通道敏感阻断药物和各自不同的激活/失活电位进行鉴别和区分。

主要有：内向整流钾电流、延迟整流钾电流、瞬间外向钾电流。

随着膜片钳技术的不断完善，可能会新发现更多的离子通道类型，并阐述其结构与功能。

3.对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究，了解该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。

如对钙离子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明，缺血性脑损害过程中，Ca2+ 介导现象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道开放，过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载，导致神经元及细胞膜损害，膜转运功能障碍，严重的可使神经元坏死[10]。

4.对单细胞形态与功能关系的研究将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链是反应技术结合，在全细胞膜片钳记录下，将单细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA，再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测，借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本，为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。

目前国际上掌握此技术的实验室较少，我国北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。

5.对药物作用机制的研究在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。

这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。

如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺血细胞可能有保护作用。

陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。

6.在心血管药理研究中的应用随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新，而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。

正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。

膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物或毒素，研究他们对通道功能的可能影响。

通过研究，一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物或毒素影响动物和人生理功能的分子机理；另一方面，分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点，提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。