大肠杆菌高活性氨基酸生物合成途经研究

研究目的：

汽油替代品：高能量密度、低吸湿性、辛烷值

传统生物燃料&高级醇；直链醇&支链醇

研究菌体：大肠杆菌

方法技术：

代谢工程：高活性氨基酸生物合成途经+埃利希途径（Ehrlich pathway）

葡萄糖→2-酮酸中间体→高级醇（异丁醇、1-丁醇、2 -甲基- 1-丁醇、3-甲基-1-

丁醇和2-苯乙醇）

实验部分：

一、异丁醇

前期实验：

1）2-酮酸是氨基酸生物合成途径的中间产物；通过2-酮基酸脱羧酶（KDC）转化为醛；通过醇脱氢酶（ADH）转化为醇类。通过实验，测定Kivd是所有测试酶中活性最高且最具有多样性的KDC，ADH选用乙醇脱氢酶2，二者均来自酵母菌。

2）不同种类的2-酮酸（表2）加入到表达Kivd的大肠杆菌培养菌中会将相应醇类的产量提

高2~23倍。特种2-酮酸的供应也明显地削减了其他醇类的产量。这些结果均表明增加特种2-酮酸的量可以提高醇类的产量和选择性。

大肠杆菌已有的代谢途径被转基因改造，增加特种2-酮酸的产量，可以生产出期望的醇类。

设计菌株：

1）为合成异丁醇，质粒内PLlacO1启动子控制的ilvIHCD基因被过度表达以增大2-酮异戊酸生物合成量。

2）强化ilv合成途径和乙醇合成途径（Kivd 和Adh2）。

菌株可产生出23 mM异丁醇，这约是普通菌株产量的五倍

3）进一步提高异丁醇的产量，需要删除控制合成副产物的基因，包括adhE，ldhA，frdAB，fnr 和pta。这些基因的删除可提高用于ilvIHCD合成途径的丙酮酸的量。

敲出基因后的菌株产生了30 mM异丁醇。

4）选用枯草芽孢杆菌的alsS基因取代大肠杆菌的ilvIH基因。相比于大肠杆菌更偏向酮丁酸的ilvIH基因，alsS基因对丙酮酸盐有更强的亲和力。

采用alsS途径的菌株可产生约50 mM的异丁醇。

5）为进一步增加丙酮酸盐的量，pflB基因被敲出。

在这些操作的综合作用下，可以在微好氧条件下使异丁醇的产量达到约300mM (22 g/l)。

实验结果：

通过此种方法由葡萄糖获得了高产量、高选择性的异丁醇

二、正丁醇

1）1-正丁醇的前提2-酮基戊酸乙酯不是大肠杆菌的代谢物。，作者尝试以与亮氨酸生物合成途径相似的方法，以一种分子比2-ketovalerate少一个甲基的更小的分子——2-酮丁酸为底物，合成2-ketovalerate。2-酮丁酸可以通过由ilvA基因编码的苏氨酸脱水酶作用苏氨酸生成。

2）为进一步提高1-丁醇的产量，编码二羟酸脱水酶的基因ilvD被敲除。二羟酸脱水酶能够同时产生2-酮基异戊酸（亮氨酸和缬氨酸的前体）和2-酮基3-甲基戊酸（异亮氨酸的前体）。此种操作有两个优点：首先，ilvD基因的敲除避免了leuABCD代谢途径的自然底物2-酮基异戊酸的生成，进而抑制了目的产物的竞争底物。其次，ilvD基因的敲除避免了Kivd的竞争底物2-酮酸-3-甲基-戊酸和2-酮酸-4-甲基戊酸的产生。故而ilvD基因的敲除进一步增加了1-

丁醇的产量。

三、提高耐受性

为了探索耐受性的可提高程度，我们对于正丁醇耐受性的菌株进行传代培养。我们发现，原生的大肠杆菌对于正丁醇的耐受性为1.5%。然而，菌株在正丁醇浓度不断增加的环境下进行传代培养五代之后，便会出现对正丁醇的耐受性达到2%的基因突变菌株（补充材料中的图4）。这种菌株的耐受性可达到与1-丁醇的原生生产者相当或甚至优于原生生产者。

证明大肠杆菌可以适应长链醇类的高浓度环境。之后还可以运用诸如全转录工程（gTME）等其他的方法进一步提高耐受性。

优势：

1、本方法使用大肠杆菌作为研究菌体，但这种方法可以在诸如酿酒酵母菌的其他温和菌体

上实现。这些寄主微生物生长速率快，且为兼性厌氧菌，这为大规模生产提供了可操作性和经济上的可实现性。

2、这种方法摒弃了辅酶A介导的化学这种在原生微生物中生产醇类物质的普遍化方法，使

得合成其他分子量更大、更复杂的醇类成为可能。