牛大力离体培养与植株再生条件的优化

牛大力离体培养与植株再生条件的优化

摘要：分别以野生牛大力（Milletia speciosa）成熟种子、带芽茎段为材料研究不同激素组合及外植体的离体培养效果。结果表明，1 g/L HgCl2对牛大力种子和带芽茎段分别消毒10 min和15 min效果最好；愈伤组织和不定芽诱导的最佳激素组合为1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA，种子和带芽茎段外植体的最高不定芽诱导率分别为95.8%和45.8%；最适合不定芽分化的激素组合为2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA，最高分化率为58.3%；最佳的生根培养基为1/2MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，生根率高达70.8%；最佳移栽基质为等体积混合的黄土、泥炭和河沙，移栽90 d后成活率为73.3%。

关键词：牛大力（Milletia speciosa）；离体培养；种子；带芽茎段；愈伤组织；移栽

Study on in vitro Culture and Plant Regeneration of Milletia speciosa

Abstract：Using seeds and stems with buds of wild Milletia speciosa as material，the effects of different hormone combination and explants on the in vitro culture were investigated. The result showed that the optimum treatment time of 1 g/L HgCl2 for seed and stem was 10 and 15 min respectively. The best hormone combination for callus and adventitious buds induction was 1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA，the highest callus induction rate of seeds and adventitious buds of stem with a bud was 95.8% and 45.8%，respectively. The best medium for differentiation of adventitious bud was 2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA；the differentiation rate was 58.3%. And the best rooting medium was 1/2MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA；the rooting rate was 70.8%. The best matrix was mixture of equivalent volume of loess，peat and river sand，the survival rate of 90 days after transplantation reached 73.3%.

Key words：Milletia speciosa；in vitro culture；seed；stem with buds；callus；transplant

牛大力（Radix Millettia Speciosa），又名山莲藕、金钟根、倒吊金钟等，为蝶形花科植物美丽崖豆藤（Milletia speciosa Champ.）的干燥根[1]，是著名的南药之一，其味甘、性平，归肺、肾经[2]，在海南、两广地区广泛用作煲汤原料、制作药膳、药酒等[3-7]，临床研究证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺结核、慢性支气管炎等具有一定疗效[8]。近年来由于市场需求剧增，牛大力野生资源经过多年采挖，蕴藏量逐渐减少，生产及制药原料供应日趋紧张，价格不断攀升[9]。目前牛大力的人工栽培技术尚不成熟，通过组织培养技术进行快速繁殖也还停留在初步研究阶段[10-12]。本实验在前人工作的基础上，以牛大力种子、带芽茎段为外植体进行愈伤组织及不定芽的诱导，筛选出最佳的灭菌方法和各个生长阶段的最佳激素组合，建立牛大力的无性培养技术，为保护和开发牛大力资源、实现其可持续发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

牛大力种子于2011年5月采自广西隆安，带芽茎段于2011年5月采自从海南引种的移栽苗，取材时间为上午9∶30～10∶00

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒取牛大力成熟种子放入烧杯中，添加2滴洗洁精清洗表面污垢，流水冲洗8～10 min后移至超净工作台，体积分数75%的乙醇浸泡40 s，无菌水冲洗1次，再用1 g/L HgCl2消毒6～15 min，无菌水冲洗5次。

选取生长健壮、无病虫害的植株，剪取幼嫩带芽茎段作为外植体，剪除叶片后放入烧杯中，加适量自来水及2～3滴洗洁精，轻轻摇动，用棉花轻轻擦洗表面泥土，然后在自来水下冲洗15 min，体积分数75%的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗1次，再用1 g/L HgCl2消毒10～20 min，无菌水冲洗5次。用无菌滤纸吸干种子和茎段外植体表面水分后用消毒好的镊子夹住，插入培养基中，每瓶接种3个外植体，每个处理接种8瓶。

1.2.2 不同激素组合对牛大力组织培养的影响基本培养基为MS，含 5 mg/L琼脂、30 mg/L蔗糖，pH 5.8～6.0。将消毒好的牛大力种子、带芽茎段接种到含0.5 mg/L NAA，6-BA浓度分别为1.0、1.5、2.0 mg/L或0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA，IBA浓度分别为0.1、0.3、0.5 mg/L的培养基上进行愈伤组织和不定芽的诱导；取种子、带芽茎段诱导后所产生的不定芽接种到含0.5 mg/L NAA，6-BA浓度分别为1.5、2.0、2.5 mg/L的固体分化培养基上进行分化培养。将生长健壮、高2～4 cm的不定芽或者芽丛接种到分别以MS和1/2MS为基本培养基，添加不同浓度NAA和IBA的壮苗生根培养基上进行生根培养。培养条件均为培养温度（25±2）℃、光照时间12 h/d，光照强度20～30 μmol/（m2·s）。30 d 后统计出芽率、污染率、分化率、生根率等指标。

2 结果与分析

2.1 不同外植体的灭菌效果

先用体积分数75%的乙醇浸泡种子和带芽茎段，再用1 g/L HgCl2对2种牛大力外植体材料灭菌，不同处理时间下的灭菌效果见表1。从表1可以看出，用1 g/L HgCl2对牛大力种子进行灭菌后种子均能出芽，而且出芽率较高。消毒时间为10 min时出芽率最高，为91.7%，而且其污染率也最低，为8.3%，所有种子均未产生愈伤组织和出现褐化。而茎段消毒后出芽率相对较低，1 g/L HgCl2消毒时间为15 min时其出芽率最高，为41.7%。此时愈伤组织诱导率也最高，为54.2%；而污染率较低，为4.2%，且褐化率为0。

2.2 不同激素组合对牛大力愈伤组织和不定芽诱导的影响

外植体在添加0.5 mg/L NAA和不同浓度6-BA的培养基中进行培养，诱导率和出芽率结果见表2。在激素组合1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的培养基中，种子培养5 d后开始出芽，芽嫩绿、粗大（图1），而茎段出芽时间较晚，培养15 d后才开始冒出嫩绿的小芽，且芽相对细弱（图2），大部分茎段在诱导培养10～20 d后逐渐形成愈伤组织（图3）。从表2可看出，牛大力的种子和带芽茎段在含不同浓度激素组合的培养基中的愈伤组织及不定芽诱导率不同，与仅添加6-BA和NAA的处理相比，附加IBA后愈伤组织和不定芽诱导率均得到明显提高，1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA +0.3 mg/L IBA处理中两种外植体的不定芽诱导率均为最高，分别为95.8%和45.8%，带芽茎段的愈伤组织诱导率也高于其他处理。