微生物综合实验

微生物综合实验

——土壤微生物的分离、纯化及鉴定摘要：利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，通过对菌落形态的观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果，辅以菌株耐药性测定，最终通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征，判断所分离纯化的细菌所属的属。

关键词：土壤微生物，分离纯化，鉴定，耐药性，《伯杰氏系统细菌学手册》

前言：土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。

据统计，每克土壤中含有微生物数量几亿到几十亿不等，包括了从细菌，真菌，藻类以及原生动物几乎所有的类群。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。

土壤内含有细菌生活所需的氮素养料(NH4+，No3-)，各种盐类及微量元素，一般还含有1一15％有机物质(来源予死亡的动植物及动物排泄物)。地表下一定深度的土壤中含有丰富的水分和空气。土壤的PH接近中性，也适宜细菌生活。土壤是由大小不等的团粒组成，团粒之间的孔隙为水和空气所充满，细菌就是生活在这些孔隙中。由于胶体表面的吸附性质，使细菌和土壤中的有机、无机物质互相吸附着而形成无机——有机——生物复合体。所以土壤是细菌生活的良好环境，在其中含有大量的细菌和其它微生物。一克耕作土壤约含几亿细菌和放线菌，几十万个霉菌、5万个藻类植物和25万个原生动物。

通过土壤微生物的分离纯化，得到纯种，再进行相关的实验，如：菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色、生理生化试验等，根据实验结果，查阅《伯杰氏系统细菌学手册》确定所分离纯化细菌所属的属。在此过程中熟悉相关操作。

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【实验目的】

1.掌握从土壤中分离纯化细菌的能力

2.掌握培养基的制备与灭菌技术

3.微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。

4.掌握微生物基本鉴定的方法。

5.学会利用微生物的生理生化特性对微生物进行定属。

6.实验基本操作的练习和提高。

7.提高团队合作的意识。

【实验器材】

1、土壤样品：

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山东大学微生物楼门口石碑后10cm深的土壤样品10g

2、试剂：

a.微生物基本鉴定：草酸铵结晶紫染液、卢戈氏染液、95%乙醇，番红复染液、5%孔雀绿

水溶液，%番红水溶液等

b.生理生化实验：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等

c.头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类四种抗生素

d.其它：香柏油和二甲苯、无菌水等

3、仪器和用具：

酒精灯、接种针、平皿、试管、试管架、烧杯、量筒、锥形瓶、德汉氏小管、显微镜、擦镜纸、PH试纸、载玻片、载玻片夹子、玻璃涂棒、镊子、滴管、纱布、牛皮纸、等4、培养基

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LB液体培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

淀粉培养基、油脂培养基（大分子物质水解实验）

葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内附倒置的德汉氏小管）（糖发酵实验）

蛋白胨水培养基（吲哚实验）

葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红实验）

【实验原理】

一、土壤微生物的的分离及纯化

自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。

平板分离法主要有：I平板划线分离法II稀释涂布平板法.后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数量。

平板菌落计数法: 是将待测菌液经过适当稀释，涂布在平板上,经过培养后，在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。由于待

测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖形成的，有的可能来自2个或多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

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④菌落形态描述: 通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个聚集在一起的肉眼可见的菌落。平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，将样品接种于培养基上，在37℃温度下培养，1—2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

二、微生物基本鉴定

1、革兰氏染色

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G- 表示。

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；

革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

2、芽孢染色

芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。

与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍保留。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

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3、细菌运动性检测——半固体穿刺法

将细菌穿刺培养于半固体培养基中，经培养后，无鞭毛的细菌沿穿刺线生长，穿刺线清晰说明该种菌不具有运动性；有鞭毛的细菌沿穿刺线向四周扩散，穿刺线模糊不清，说明该种