脂肪干细胞的提取及鉴定
一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法[发明专利]
![一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f7ea2d2cb6360b4c2e3f5727a5e9856a56122602.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610073412.7(22)申请日 2016.02.03C12N 5/0775(2010.01)C12Q 1/02(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)G01N 15/14(2006.01)(71)申请人广西大学地址530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学东路100号广西大学动物科学技术学院(72)发明人杨素芳 韩杰 李海洋 邓彦飞石德顺 朱鹏 杨海燕 韦精卫李湘萍 黄奔(54)发明名称一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法(57)摘要本发明公开了一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法，包括以下步骤，1)脂肪干细胞的分离培养和纯化；2)脂肪干细胞的传代培养；按照本发明方法所得到的脂肪干细胞遗传稳定性好，体外连续培养到15代仍然保持遗传稳定性；干性好，体外培养传代到第18代仍具有间充质干细胞表面抗原特性；多向分化性能好，具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书12页 附图5页CN 105602896 A 2016.05.25C N 105602896A1.一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，所述消化采用Liberase TL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h；所述的Liberase TL的浓度为15～25μg/mL，Liberase TL与脂肪组织的体积比为0.5～1∶1；2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的脂肪组织消化前还包括以下步骤：采集猪脂肪组织；将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有0.45～0.5g/L 青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后A C Ss的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除AS Cs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DM EM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsi n,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（C D29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
脂肪干细胞实验报告
一、实验背景随着生物科技的发展，干细胞研究已成为医学领域的前沿课题。
脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）作为一种易于获取、增殖能力强、多能性的干细胞，在组织工程、再生医学等领域具有广阔的应用前景。
本研究旨在探讨脂肪干细胞的分离、培养、鉴定及其在组织工程中的应用。
二、实验目的1. 探讨脂肪干细胞的分离、培养及鉴定方法。
2. 研究脂肪干细胞在组织工程中的应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脂肪组织、DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素、链霉素、抗生素、鼠抗人CD105抗体、鼠抗人CD34抗体、鼠抗人CD29抗体、鼠抗人CD44抗体、鼠抗人CD45抗体等。
2. 实验仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 脂肪干细胞的分离与培养（1）将脂肪组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用DMEM/F12培养基清洗3次，去除多余脂肪。
（2）加入0.25%胰蛋白酶消化脂肪组织，37℃水浴消化30分钟，1000r/min离心5分钟，弃上清。
（3）加入DMEM/F12培养基重悬细胞，吹打均匀，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 脂肪干细胞的鉴定（1）采用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
（2）采用流式细胞术检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
3. 脂肪干细胞在组织工程中的应用（1）将脂肪干细胞接种于生物降解支架材料上，构建组织工程化脂肪组织。
（2）将组织工程化脂肪组织植入小鼠皮下，观察其成活情况。
五、实验结果1. 脂肪干细胞的分离与培养成功分离出脂肪干细胞，细胞呈梭形，生长旺盛。
2. 脂肪干细胞的鉴定免疫荧光染色和流式细胞术结果显示，脂肪干细胞表达CD105、CD34、CD29、CD44，不表达CD45。
人脂肪干细胞的分离、培养及鉴定
人脂肪干细胞的分离、培养及鉴定李玉秋;张雷雷;黄飞【摘要】目的:探讨胶原酶消化法从人脂肪组织中提取脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的可行性.方法:采用胶原酶消化法将真空抽脂术抽取的新鲜脂肪组织进行消化分离,获取ADSCs并进行培养,用流式细胞术鉴定ADSCs的表面特异性标志物CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果:利用胶原酶消化法可成功提取ADSCs,其标志物CD44和CD105表达阳性,CD34为低表达,CD45表达为阴性.结论:通过胶原酶法可成功提取人ADSCs.【期刊名称】《沈阳医学院学报》【年(卷),期】2018(020)006【总页数】4页(P495-498)【关键词】人脂肪干细胞;细胞分离;细胞培养;细胞鉴定【作者】李玉秋;张雷雷;黄飞【作者单位】山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003;山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003;山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003【正文语种】中文【中图分类】R329.2脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是2001年Zuk等［1］从真空吸脂术抽出的脂肪中发现的一种间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），其含量约占脂肪组织的10%～20%［2］。
ADSCs同其他MSCs一样，具有自我更新和多向分化的潜能，是成体干细胞的一种，在疾病治疗领域有巨大的潜力。
但ADSCs较骨髓干细胞有更高的提取率，其提取率可高达1%～2%，是骨髓干细胞的1 000倍［3］。
ADSCs已成为研究者们青睐的种子细胞，本文就ADSCs的提取、培养和鉴定进行研究。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 脂肪组织选取滨州医学院附属医院产科剖宫产产妇皮下脂肪组织，产妇无其他基础疾病，未经过特殊药物治疗，取材前均获得医院伦理委员会批准和产妇知情同意。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪间充质干细胞提取方法
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序一、试剂准备（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：试剂名称浓度商品信息1.极限必须培养基(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L(SH30021.01B, Hyclone)2.胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）10%(ES-009-B, Millipore)3.青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）1%（TMS-AB2C, CHEMICON）4.地塞米松(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46(D4902-25MG, Sigma)5.胰岛素(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808(91077C—1g, Sigma)6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24( I5879-100MG, Sigma)7.吲哚美辛(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79(I7378—5G, Sigma)（二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称质量浓缩倍数配制方法1.Stock A胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃2.Stock B青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃3.Stock C地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300保存：-20℃4.Stock D胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100保存：4℃5.Stock E3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃6.Stock F吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100保存：-20℃（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;2.加1管Stock A（1ml）；3.加1管Stock B（0.1ml）；4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；5.加1管Stock E（0.05ml）；6.加1管Stock F（0.02ml）；7.加1管Stock D（0.1ml）；8.测渗透压，调pH7.2-7.4;9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。
ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。
大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。
同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。
目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。
为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。
1 脂肪组织采集1.1 脂肪组织采集机构要求脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。
采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。
采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。
人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定
人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定李洪超;金银鹏;王皙;李莉;王晓今;周荣;陈成伟;傅青春;程明亮【摘要】背景:间充质干细胞如今在科研领域被广泛地研究和应用,许多研究认为其发挥作用的机制很大程度上依赖于其旁分泌的外泌体.目的:分离纯化人脂肪干细胞来源的外泌体,并鉴定其生物学特性.方法:采用胶原酶消化法获得人脂肪干细胞,进行细胞表面分子标志和成骨、成脂分化能力鉴定.运用超滤法从人脂肪干细胞条件培养基中提取外泌体,应用扫描电子显微镜、粒度仪观察所获外泌体的形态和大小,采用抗体芯片检测外泌体所含蛋白质表达.结果与结论:①人脂肪干细胞呈梭形、漩涡状生长,细胞表面表达CD73、CD44、CD90、CD105分子,具备成脂、成骨等多向分化潜能,可证实为人脂肪干细胞;②大多数外泌体直径均在30-150 nm范围内;扫描电镜显示外泌体呈均一大小的圆杯形态;③抗体芯片显示外泌体含 FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、ANXA5、TSG101等多种特殊蛋白;④以上结果表明实验成功分离得到人脂肪干细胞外泌体.%BACKGROUND: Currently, mesenchymal stem cells have been widely explored and applied in scientific research field, and many studies suggest that the underlying mechanism of mesenchymal stem cells mainly relies on its exosomes. OBJECTIVE: To isolate and identify human adipose-derived stem cells and its exosomes, and to identify their biological characteristics. METHODS: Human adipose tissue was digested with collagenase l, and adipose-derived stem cells were isolated and purified. Immunophenotype, osteogenic and adipogenic abilities of adipose-derived stem cells were identified. Exosomes were isolated by using ultrafiltration method. Morphology of exosomes was observed by Nanosight and electronmicroscope. Expression of proteins in exosomes was detected by antibody array method. RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells exhibited long spindle-like or fibroblast-like appearance, expressed CD73, CD44, CD90, CD105 and had the potential to differentiate into many tissues, including bone and adipose tissues. The exosomes had the similar size, with the diameter of 30-150 nm. They possessed many proteins including FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, CD63, ANXA5, TSG101, and so on. Findings from the present study indicate the successful isolation of exosomes from human adipose-derived stem cells.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)013【总页数】6页(P2033-2038)【关键词】外泌体;干细胞;间充质干细胞;脂肪干细胞【作者】李洪超;金银鹏;王皙;李莉;王晓今;周荣;陈成伟;傅青春;程明亮【作者单位】贵州医科大学临床医学院,贵州省贵阳市 550004;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;贵州医科大学临床医学院,贵州省贵阳市550004;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;贵州医科大学附属医院感染科,贵州省贵阳市550004【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，不仅能够从骨髓、脐带、脂肪中分离，也可以从脾脏、肝脏、肾脏、肺、胰腺中得到，尽管其组织来源不同，但是都拥有相似的表型特征[1-4]。
人脂肪来源间充质干细胞的制备及其质量检验方法
人脂肪来源间充质干细胞的制备及其质量检验方法陈冲;闫俊灵;李梁;徐潇;丁红;汤苏阳【摘要】目的：研究人脂肪来源间充质干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）的制备及其质量检验方法，为临床研究提供安全合格的干细胞。
方法取50例人吸脂术抽取的脂肪，剪碎，用胰酶和胶原酶消化、分离、培养，并按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》对其进行细胞形态、数量、活率、无菌、支原体、人源特定病毒及猪源病毒、内毒素、免疫抑制活性、分化能力、免疫表型等检测及染色体核型。
结果50例hADSCs；细菌、内毒素检测阴性，无内外源致病菌；干细胞免疫表型检测CD90、CD105表达阳性，阳性率＞95％，CD34、CD45和HLA-DR表达阴性，阳性率＜2％；具有成骨、成脂分化潜能；能抑制异体淋巴细胞的增殖。
间充质干细胞活性冻存前≥92％，冻存复苏后≥82％。
结论按照本工艺及标准制备的hADSCs符合质量控制标准，为同类干细胞制备及其检定过程标准化提供了试验依据。
%Objective To study the human adipose derived mesenchymal stem cells in vitro amplification and quality inspec-tion methods and provide safe and qualified stem cells for clinical research .Methods Fifty human source liposuctioned fat , sheared, underwent trypsin and collagenase digestion , separation, culture, and according to the “stem cell-based medicinal product quality con-trol of pre clinical research guidi ng principle” to detect the cell morphology , quantity, live rate, sterilization, mycoplasma, human source specific virus and swine virus , endotoxin , immunosuppressive activity , differentiation ability , immunophenotype detection and chromosome karyotype .Results Human adipose derived mesenchymal stem cell activity beforecryopreservation is ≥92%, after re-vival≥82%;bacteria and endotoxin test negative , no internal and external source pathogenic bacteria;stem cell immunophenotype de-tection of CD90, CD105 positive, the positiverate >95%, CD34, CD45 and HLA-DR negative expression , the positive rate <2%;with osteogenic and adipogenic differentiation proficiency ,it can inhibit the proliferation of allogeneic lymphocytes .Conclusions The preparation process and the standard of human adipose derived mesenchymal stem cell line according to the quality control standardof“stem cell-based medicinal product quality control of pre clinical research guiding principle ”, it provides the experimental basis for the similar stem cell preparation and standardizing verification process .【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】5页(P170-174)【关键词】脂肪干细胞;间充质干细胞;质量控制;免疫表型;分化潜能;染色体核型分析【作者】陈冲;闫俊灵;李梁;徐潇;丁红;汤苏阳【作者单位】100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科【正文语种】中文【中图分类】R329.2人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)，是从脂肪组织中分离获得的一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞[1]，是极具前景的组织工程和基因治疗的种子细胞。
人脂肪干细胞的分离培养及鉴定
。
．
图 ３ 脂 肪 干 细胞 的表 型 特 征
被 称 为 Ａ Ｓ ｓ的 细 胞 ， 具 有 一 般 干 细 ＤＣ 它 胞 的 特性 ， 骨 髓 干 细 胞 相 比 ， 具 有 明 与 它 显优 势 ， 来 源 、 材 、 增 能 力 方 面 ， 在 取 扩 都
是骨 髓 干 细 胞 所 无 法 比拟 的 ， 可作 为 种 子
到第 １ ４天 时 可 见 细 胞 铺 满 瓶 底 ８ ％ 左 ０
右 。 而传 代 细 胞 生 长 速 度 明 显 快 于 原 代
陶凯 等 通 过 不 同 血 清 浓 度 作 用 下 生 长 曲线 绘 制 发 现 ， 血 清 浓 度 为 １％ 在 ５ 和 ２ ％ 时 ， 最 短 时 间 内 细 胞 可 进 入 平 ０ 在 台期 ， 到 细 胞 增 殖 高 峰 期 ， 合 考 虑 性 达 综 价 因 素 ， 际 应 用 中 可 将 １％ 作 为 血 清 实 ５ 的最 适 宜 浓 度 。通 过 两代 生 长 曲线 发 现 ， 第 ２代 细 胞 较 原 代 细 胞 更 快 进 入 增 殖 高
摘
要 目的 ： 索从 健 康 成人 脂肪 组 织 探 中分 离 、 养 并 鉴 定 脂 肪 千 细胞 。 方 法 ： 培
用健 康 成 人 的 脂肪 组 织 ， 除 可 见 纤 维结 剔
１ ， 次 当贴 壁细 胞接 近融 合时再 次传 代。
光学 显 微 镜 下 观察 细胞 生 长 及 形 态 。 流 式 细 胞 仪检 测 相 关 抗 原 ： 流式 细 胞 仪对 第 ３代 脂 肪 干 细 胞 表 面 相 对 特 异 性
２ 王红祥 ， 李宾公 ， 邵诗颖 ， 人脂肪组 织分 等． 离培养基 质 干细胞 的方 法及 其 表型 鉴定 ［ ］ 中国临床康复，０ ６，０ ４ ） １ Ｊ． ２０ １ （ １ ：６—１ ． ８
人脂肪干细胞的分离和成脂诱导及鉴定
13BIOTECHWORLD 生物技术世界1 前言间充质干细胞是由一组不同分化潜能的细胞组成的。
MSC存在于多种组织,主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、皮肤结缔组织、胚胎组织、脐带、脐血及外周血等。
由于MSC具有多向分化潜能,在一定实验条件诱导下可向不同胚层的细胞分化[1]。
2001年,Zuk [2]等从抽脂术废弃的脂肪组织中,分离出脂肪干细胞,并证明这种丰富且能再生的组织可作为未来组织工程的细胞来源。
体外实验显示在特定培养条件下,MSC可分化为中胚层起源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞等。
本文通过体外培养的方法从脂肪组织中筛选出ADSCs [3],进一步研究脂肪干细胞体外分离培养的方法,并进行染色和表面抗原鉴定,为ADSCs 相关研究提供参考。
2 材料与方法:2.1 样品来源:人腹部抽脂50ml 2.2 试剂PBS(磷酸盐缓冲液),Hyclone;DMEM/F-12 1:1,Hyclone;0.1% I型胶原酶;Ul troser-G,PALL;L-Glu ,GIBCO;0.25%胰酶,Life;地塞米松, SIGMA;IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤);油红O;异丙醇;75%酒精。
2.3 ADSCs 分离和培养收集脂肪组织后,加入等体积的PBS,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复离心2遍,保留上层脂肪层和下层沉淀细胞。
向含有脂肪层的离心管中加入等体积的0.1%I型胶原酶,37℃,水浴8min,加入等体积PBS 终止消化,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复消化离心3遍,最后弃去上层脂肪层。
将两次收集到的沉淀合并,用PBS洗一次,离心弃上清。
用注射用水裂解红细胞,离心收集沉淀。
取3×106个细胞接种到T175 cm 2 细胞培养瓶中,用含有2% Ul troser-G和1% L-Glu的DMEN/F-12培养,24h,次日收集细胞液,下层贴壁细胞为成纤维细胞,将细胞液重新接种到新的T175 cm 2 细胞培养瓶中,隔三天换液一次,培养期间根据细胞生长情况传代,培养到第14天时收获细胞[4]。
人脂肪干细胞的提取和鉴定
人脂肪干细胞的提取和鉴定吴尉;梁芳;宋小琴;胡平安;刘敏【摘要】BACKGROUND:Adipose-derived stem cel s are totipotent stem cel s in the adipose tissue, and have the function of self-renewal and multi-directional differentiation. Human adipose-derived stem cel s are ideal seed cel s with stable genetic milieu and few rejections. <br> OBJECTIVE:To extract human adipose-derived stem cel s from human omental adipose tissue and to identify the cel s by adipogenic and osteogenic induction. <br> METHODS:Omental adipose tissues were col ected from surgical patients to isolate and culture adipose-derived stem cel s using type I col agenase digestion, filtration and centrifugation. Cel growth was observed and proliferative curve of human adipose-derived stem cel s were drawn by cel counting method to calculate the doubling time at logarithmic growth phase. After adipogenic and osteogenic induction, induced cel s were identified using oil red O and alizarin red staining, respectively. <br> RESULTS AND CONCLUSION:Human adipose-derived stem cel s were successful y isolated from the omentum tissues of surgical patients. Adherent cel s were fusiform-shaped and like fibroblasts. The growth curve of passage 3 cel s was in S shape, and the doubling time was 45.90 hours. After adipogenic and osteogenic induction for 2 and 3 hours, respectively, oil red O staining showed unequal-sized orange fat droplets, and alizarin red staining showed typical calcified nodules that were in orange. These findings indicate that adipose-derived stemcel s have the adipogenic and osteogenic capacity.%背景：脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞，具备自我更新能力与多向分化潜能，遗传背景相当稳定，体内植入后免疫排斥少，是一种比较理想的种子细胞。
人脂肪干细胞的培养及鉴定
人脂肪干细胞的培养及鉴定尚志刚;郭琼;李甜;白生宾;钟近洁;秦纹;冯树梅【摘要】Objective To establish an effective method on isolating and identifying Human adipose stem cells(hADSCs). Methods Collagenase digestion was adopted to isolate stem cells from human adipose tissue.These isolated cells were subcultured and passaged in vitro,the morphology and cell growth curve were characterized subsequently.Moreover,flow cytometry and multi-lineage differentia⁃tion ability were identified. Results The obtained cells with spindle-shape were adherent monolayer cells,and were arranged in whirlpool or radiation.The cell growth curve was a typical“S”shape ,indi⁃cating a 26h of doubling generation time.These cells are positive for CD29,CD105,CD44,negative for CD45 showed by Flow cytometry.The positive results of oil red and alizarin red staining also indicated that the obtained cells were pluripotent. Conclusion HADSCs could be obtained from human abode⁃men adipose tissue through a series of isolation and identified methods.%目的：探讨人脂肪干细胞的分离、培养并鉴定。
小鼠脂肪干细胞提取方法-概述说明以及解释
小鼠脂肪干细胞提取方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：随着干细胞研究领域的不断深入，小鼠脂肪干细胞作为一种重要的干细胞资源备受关注。
小鼠脂肪干细胞具有较高的分化潜能和增殖能力，可广泛应用于再生医学、组织工程和疾病治疗等领域。
提取小鼠脂肪干细胞是进行相关研究的基础和关键步骤，因此本文将详细介绍小鼠脂肪干细胞的提取方法及其在研究中的应用。
通过深入探讨小鼠脂肪干细胞的重要性和相关提取方法，旨在为读者提供实用的研究参考和启发，促进小鼠脂肪干细胞研究领域的进一步发展。
1.2 文章结构本文主要分为引言、正文和结论三部分。
在引言部分，将介绍小鼠脂肪干细胞的重要性，并简要阐述文章的结构和目的。
正文部分将详细介绍小鼠脂肪干细胞提取方法，包括提取的步骤、操作注意事项和实验流程。
同时还会探讨小鼠脂肪干细胞在研究中的应用，如在生物医学研究中的作用和潜在应用价值。
在结论部分，将对提取方法的重要性进行总结，并展望小鼠脂肪干细胞研究的未来发展趋势。
最后，对整篇文章进行总结，强调小鼠脂肪干细胞研究的重要性和潜在价值。
1.3 目的小鼠脂肪干细胞作为一种重要的细胞资源，在干细胞研究领域具有广泛的应用价值。
本文旨在探讨小鼠脂肪干细胞的提取方法，为相关研究人员提供可操作的实验指导，推动小鼠脂肪干细胞研究的进展。
同时，通过总结现有提取方法的优缺点，展望未来小鼠脂肪干细胞研究的发展方向，为更深入的研究提供理论基础和实践指导。
通过本文的阐述和分析，旨在促进小鼠脂肪干细胞领域的持续发展，推动干细胞研究的进步。
2.正文2.1 小鼠脂肪干细胞的重要性:小鼠脂肪干细胞是一种来源于小鼠脂肪组织的多能干细胞，具有很高的潜在应用价值。
首先，小鼠脂肪干细胞具有自我更新和多向分化的能力，可以分化成多种细胞类型，如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，这使得它们在再生医学领域具有重要意义。
其次，小鼠脂肪干细胞来源广泛，并且易于提取和培养，这为研究人员提供了便利。
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脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定
1、实验技术及原理:
运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:
2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠
2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M
2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗
3、细胞培养的方法与步骤:
3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:
3.2.1操作步骤
a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
c. 消化:将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶(0.075%II型胶原酶, PH)，用量(0.1-0.3ug/ml或200U/ml)，再用移液管移至烧瓶中，置于37?水浴或恒温箱中30分钟)，每隔5-10min振荡一次。
30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。
d. 离心和计数:将离心管做好标记，平衡后以(1200g,1200r/min 10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min 离心10分钟(先后顺序)，得到单个核细胞。
加入培养液吹打混匀后取样计数。
根据?计数结果调整细胞浓度为10个细胞/ml。
e(接种培养:每10cm2的培养瓶接种1ml的细胞悬液，再添加4ml的培养液，盖紧瓶塞。
标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37?5%CO2孵箱培养。
3.2.2 观察
每天对接种培养的细胞做常规性检查。
观察的主要内容:污染与否、细胞生长状态和pH(培养液颜色变化)等情况。
如发现培养液变为柠檬黄色有浑浊，表明已被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。
如培养液颜色变为紫色，可能系培养瓶有裂口或瓶塞漏气，CO2逸出或由于细胞生长不良有大量死亡。
如培养液为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。
在没有发生污染，接种24h后，可见到许多细胞贴壁(由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状)，24小时后第一次换液，以后3天换液一次。
培养3-4天时，细胞生长繁殖，细胞数量增加，并可见细胞形成孤立小片(细胞岛)，逐渐扩展，细胞透明，颗粒啥，界线清晰。
7-10天细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，(80%融合后)可进行传代培养。
3.3细胞传代培养
3.3.1操作步骤
a(取一瓶脂肪干细胞在倒置相差显微镜下观察，培养细胞如长成致密的单层，即可进行传代。
b(将培养瓶带人超净工作台，倒去细胞培养液，吸取2ml-3ml PBS加入培养轻轻振荡后倾去，可重复进行一次。
瓶中，
c(加入5-8滴0.25% Trypsin,0.02%EDTA，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，置于室温下笑话2-3min。
翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜上出现针孔大小空隙时即可倒去消化液。
如见消化程度不够时可再延长消化1-
2min。
如见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能倒去消化液而直接进行下一步操作。
d(加入3ml培养液于培养瓶中终止消化。
吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。
取?样计数，调整细胞浓度为10个细胞/ml。
吸取1ml细胞悬液加到另一培养瓶中，原瓶留下1ml细胞悬液，弃去多余悬液(可分别提取1ml接种分配到多个培养瓶中)，并向每瓶中加4ml培养液。
盖好瓶盖，标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37?5%CO2孵箱培养。
3.3.2观察
细胞传代后，每天对细胞进行观察，注意污染与否、细胞贴壁和生长状态等情况
注意观察细胞五个时期的特点消化传代。
此过程中所做处理同原代培养。
(游离期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期)。
细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，这时可进行再次传代培养。
4细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定
4.1在细胞镜下作形态学观察，与正常形态比较(原代培养后，传代2-3次，ACSs呈现单层，大而扁的细胞形态，其直径在25-30um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞)
4.2细胞周期分析
分别取生长融合达30%-40%和90%以上的第三代细胞，以4?C预冷的70%冰乙醇固定，4?C放置24小时;用PBS洗涤2次;加入RNA酶10ug和碘化丙啶(PI)0.3ml 重悬细胞(4?C，30分钟)。
用流式细胞仪以FL2红色荧光条件检测。
应用Modfit LT 2.0 软件分析细胞周期。
取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
4.2细胞表面分子免疫标记的鉴定
a.方法:直接免疫荧光法
b(试剂及材料:单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE,及同型对照抗体;细胞洗液:含2%BSA、0.1%NaN3的PBS;固定液:1%多聚甲醛PBS液(pH7.2);4、流式细胞仪。
c(操作方法: 6 每个样品取2只，分别标记同型抗体作为阴性对照、待测，分别加入1个0/100ul待测细胞。
对同型对照管中加入荧光标记单克隆抗体 CD29 、CD44 对照抗体作为阴性对照，待测管加入荧光标记单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE 为实验管，各20ul，混匀。
置于于室温避光孵育 30分钟，加入2ml 的PBS，
1200r/min 离心 10min，弃上清，控干，加入固定液0.5ml(染色缓冲剂)。
先测同
型对照，再测实验管。
软件采集数据，分析阳性细胞比例。
二、携带PTN表达基因的脂肪干细胞的获取及鉴定
1、实验技术及原理:运用基因转染技术，将带PTN基因的反转录病毒载体转染
到脂肪干细胞，抗生素G418和流式细胞仪筛选，得到PTN高表达的脂肪干细胞。
2、具体操作:
2.1材料及试剂:
2.2 脂肪干细胞的准备:被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直
接决定了基因转染效率。
如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%
为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。
对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。
2.3将带PTN基因的反转录病毒载体转染到脂肪干细胞，带有PTN基因混合物
应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。
2.4用抗生素G418和流式细胞仪筛选，得到PTN高表达的脂肪干细胞
G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul
加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等,2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全
部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半
流式细胞仪分析:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3?单细胞悬液?70%
酒精固定?裂解细胞?核糖核酸酶消化?碘化丙啶染色?上机分析G1期和/M、S期比例。
G2。