体外诊断常用的几种方法和原理

时间分辨荧光免疫（简称TRF）分析法是用三价稀土离子作为示物，标

记蛋白质，多肽，激素，抗体，核酸探针或生物活性细胞，待反应体系发生后，用时间分辨光分析仪测定最后产物中的荧光强度，以此来判断反应体系中被测物质的浓度。

原理：TRF采用了双抗体夹心时间分辨免疫荧光分析法，其中抗原与已包被的抗体结合成抗体抗原复合物，洗涤后再加入銪标记抗体与已结合的抗原联接成抗一抗体—抗原—抗—抗体—Eu复合物。增强液将标记在抗体上的Eu3+离子解离到溶液中，在溶液中Eu3+离子和增强液形成了高荧光强度的螯合物。荧光强度和样品中的抗原浓度成正比。

电化学发光免疫测定(Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI).ECLI 是继放

射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术.电化学发光法源于电化学法和化学发光法,而ECLI 是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,包括了电化学和化学发光二个过程.ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定,而且还可用于DNA／RNA探针检测。

ECL 反应底物有两种：·三氯联吡啶钌和·三丙胺

电化学发光反应原理

电化学反应过程：在工作电极上(阳极)加一定的电压能量作用下,二价的三氯联吡啶钌释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶钌,同时,电极表面的三丙胺也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA+ ,并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA·,这样,在反应体系中就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+ 和具有强还原性的三丙胺自由基TPA·.

化学发光过程:具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+ 和具有强还原性的三丙胺自由基TPA·发生氧化还原反应,结果使三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+ 还原成激发态的二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+,其能量来源于三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+ 与三丙胺自由基TPA·之间的电势差,激发态[Ru(bpy)3]2+ 以荧光机制衰变并以释放出一个波长为62Onm 光子的方式释放能量,而成为基态的[Ru(bpy)3]2+.

循环过程:上述化学发光过程后,反应体系中仍存在二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+ 和三丙胺(TPA),使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以继续进行,这样,整个反应过程可以循环进行.通过上述的循环过程,测定信号不断的放大,从而使检测灵敏度大大提高,所以ECL 测定具有高灵敏的特点.

化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化

学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。