《临床免疫学与免疫学检验》教案首页

安徽理工大学医学院

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荧光免疫技术(fluoroimmunoassay)是免疫标记技术中发展最早的一

种检测方法，其将免疫学反应酶异性与荧光技术的敏感性结合起来。基本

原理是：利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上以一定的条件

与标本中的待测抗原特异性地结合，通过高发光效率的点光源，经过滤色

板发出一定波长的光，使标本结合的荧光素激发而产生荧光，借助荧光显

微镜来进行观察，可以判断待测抗原或抗体的有无。荧光免疫技术被广泛

地应用于临床检测和科学研究。

第一节荧光的基本知识

一、荧光现象

荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短的时间内发射出

的波长大于激发光波长的光。

二、荧光技术中有关的概念和参数

1．发射光谱

指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。

2．激发光谱

指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应

的荧光发射强度。

3．荧光效率

荧光物质不会将全部吸收的光能都转变成为荧光，荧光效率是指荧光

物质将吸收的光能转变序为荧光的百分率。

荧光效率=发射荧光的光量子数（荧光强度）/吸收光的光量子数（激

发光强度）

不同的荧光物质各有其特定的吸收光谱和发射光谱，即在某一特定波

长处有最大吸收峰和最发射峰。选择激发光波长在最接近于荧光物质的最

大吸收峰的波长，而且测定光波长也设定在最接近于最大发射光波峰时，

可得到最高的荧光效率。

4．荧光寿命

指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程

度时所用的时间。

5．荧光的猝灭

指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减

弱的现象。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，用以消除

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不需要的荧光。在荧光免疫技术中常用的荧光猝灭物质有亚甲蓝、碱性复红、伊文思蓝以及低浓度的过锰酸钾和碘溶液等。

6．荧光偏振

荧光偏振可用下式说明

P=（F H－F L）/（F H＋F L）

式中：P表示偏振度；F H表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度：F L是上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度。当P=0时，说明完全不偏振；P在－1至 +1之间即为部分偏振。

三、荧光物质

在荧光免疫技术中常用的荧光物质有：

1．异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)

最大吸收光波长为490～495 nm，最大发射光波长520～530 nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。

2．四乙基罗丹明(rhodamine，RB200)

最大吸收光波长为570 nm，最大发射光波长为595~600nm，呈桔红色荧光。可与FITC的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或对比染色。

3．四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)

最大吸收光波长为550 nm，最大发射光波长为620 nm，呈橙红色荧光。

4．藻红蛋白(R-RE)

最强吸收光波长为565 nm，最大发射光波长为578 nm。R-RE可以有效地与FITC一起共用488 nm激发光，常用于双色免疫荧光染色。

其他荧光物质有：

1．镧系螯合物

某些3价稀土镧系元素经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，适用于时间分辨荧光免疫测定。

2．酶作用后产生荧光的物质(荧光底物)

某些化合物本身无荧光效应，但经酶作用后所形成的物质则是强荧光物质，可以用于酶免疫荧光分析。

第二节荧光抗体的制备

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荧光抗体是将荧光素(如FITC)与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成的。

一、抗体与荧光素的结合

用于标记的抗体应具有高特异性及高亲合力；应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易解离，而未结合者易于清除；与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。

常用的标记蛋白质与荧光素的结合方法有搅拌法和透析法两种，纯化方法可采用透析法或层析分离法。

二、标记抗体的纯化

标记抗体完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以去除未结合的游离的荧光素，纯化方法可采用透析法或层析分离法。

三、去除过度标记的蛋白

结合的荧光抗体，并不是均一的，有的过量结合，有的未结合。过量结合者是非特异荧光着色的来源之一，而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用，两者皆应去除。

荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白质的结合比率(F ／P)，其测定和计算方法是：将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分别测读A280(蛋白质特异吸收峰)和标记荧光素的特异陬收峰，按公式计算。

(FITC)F／p=(2.87×A495)/(A280-0.35×A495)

(RB200)F/P= A515/A280

F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于经过固定的标本的染色，荧光抗体以F/P=1．5为宜，用于活细胞染色者以F/P=2.4为宜。将适当的F／P值的标记蛋白收集可用于不同的实验。

四、除非特异反应抗体和鉴定荧光抗体活性

其目的是去除那些非期望抗体或交叉抗体，即去除嗜异性抗体。可采用肝粉吸收法，用于吸收的脏粉最好是与试验标本同种的动物脏器。

荧光抗体活性的鉴定可用琼脂双扩散法对抗体效价进行滴定，荧光抗体的琼脂双扩效价一般大于1：16。

第三节免疫荧光显微技术

免疫荧光显微技术的基本原理是：荧光抗体可与标本切片中组织或细胞表面的抗原结合，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光，即可对标本中的抗原物质进行鉴定。

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