基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展

重组菌的稳定性受遗传及环境因素两方面的 控制， 所以可以通过基因水平的控制来限制反应器 中无质粒细胞的繁殖以提高系统中含质粒细胞的 比 例 。 在 重 组 菌 培 养 过 程 中 通 常 采 用 增 加 “选 择 压 力 ”来 提 高 重 组 菌 的 稳 定 性 。“选 择 压 力 ”通 常 包 括 ： １） 在质粒构建时， 加入抗生素抗性基因， 在生物反 应器的培养基中加入抗生素以抑制无质粒细胞（ Ｐ－） 的生长和繁殖； ２） 利用营养缺陷型细胞作为宿主细 胞， 构建营养缺陷型互补质粒， 设计营养缺陷型培 养基抑制无质粒细胞（ Ｐ－） 的生长和繁殖； ３） 噬菌体 抑 制 及 转 化 子 中 自 杀 蛋 白 的 表 达 ， 在 含 “选 择 压 ”的 培养基中培养基因工程菌可以有效地抑制 （ Ｐ－） 细 胞的生长和繁殖， 提高质粒稳定性。这种方法对于 质粒或宿主细胞本身发生了突变， 虽保留了选择性 标 记 、但 不 能 表 达 目 的 产 物 的 细 胞 无 效 。 史 悦 等 发 现 质 粒 ＰＥＴＮＨＭ 在 无 抗 生 素 选 择 压 力 下 ， 连 续 传 代 ４８ 代 后 质 粒 丢 失 的 无 质 粒 细 胞 开 始 出 现 ， 进 一 步研究表明， 卡拉霉素的选择压力能够保证质粒的 稳 定 遗 传［５］。 ３．５ 控制培养条件 ３．５．１ 培养基组成 培养基组 成成 分 及 其 比 例 对 质 粒 的 稳 定 性 影 响 较 大 ， Ｊｏｎｅｓ 和 Ｍｅｌｌｉｎｇ 研 究 了 连 续 培 养 中 Ｅ．ｃｏｌｉ 中 几 种 质 粒 的 稳 定 性 ， 分 别 以 葡 萄 糖、磷酸盐和无机盐作为限制性基质， 发现除 ｐＢＲ３２５ 外 的 大 部 分 质 粒 在 以 磷 酸 盐 为 限 制 性 基 质 时 很 快 丢 失［１３］。 周 宇 荀 等 也 发 现 抗 菌 肽 基 因 Ａｄｅｎｏ ｒｅｇｕｌｉｎ（ ＡＤＲ） 培 养 基 中 适 当 加 入 葡 萄 糖 ， 对 质 粒 的 稳 定 性 及 蛋 白 表 达 量 有 重 要 作 用［１４］。 ３．５．２ 氧传递和搅拌 对固定 化重 组 工 程 菌 菌 培 养来说， 氧传递受固定化胶粒屏障和胶粒表面高浓 度细胞的限制， 搅拌速率影响着培养液内的氧供应 和对菌体的剪切力， 强烈搅拌使固定化胶粒内细胞 浓度明显减少， 质粒稳定性也显著降低， 温和的搅
３ 提高质粒稳定性的策略 ３．１ 质粒的选择
为了构建稳定的结构体， 最好利用小的质粒， 小的质粒在高密度发酵中遗传性状比较稳定， 而大 的质粒往往由于发酵环境中各种因素的影响， 而出 现 变 异 的 几 率 较 高［３， ８］。Ｋｉｍ 等 报 道 ， 用 穿 梭 质 粒 克 隆 大 肠 杆 菌 ＤＮＡ 片 断 ， 转 化 大 肠 杆 菌 ， 重 组 质 粒 能 稳 定 地 传 代 ； 而 转 化 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ 后 ， 重 组 质 粒 在 传 代 过 程 中 发 生 分 离［９］。 ３．２ 选择合适的插入片段或重新构建表达载体
遗 传 标 记 丢 失 影 响 较 小［１］。 质 粒 的 分 离 不 稳 定 是 细 胞在分裂后分离时引起的不稳定， 由于质粒在子代 细胞中的不均匀分配而使部分细胞不含质粒， 是质 粒 丢 失 的 主 要 原 因 。质 粒 的 分 离 不 稳 定 性 常 出 现 在 两种情况， 一是传代质粒只在许多世代之后才明显 产 生 丢 失 ［２］； 二 是 带 有 质 粒 的 细 胞 与 无 质 粒 细 胞 有 不 同 的 生 长 速 率 导 致 。 外 源 基 因 载 体 ＤＮＡ 的 存 在 犹如细胞内存在多拷贝的质粒一样， 对宿主是一种 代谢负担， 当外源基因大量产生特异蛋白时， 这种 代谢压力就变得更加严重。一般条件下， 带有重组 质粒的宿主菌的生长速率低于无质粒的细菌， 由 此， 质粒的稳定性伴随着生长速率的不同而变化。 基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大的 影响， 在连续培养时， 发 现在低比生长速率（ ０．３０２ｈ－１） 下 重 组 质 粒 只 可 以 完 全 维 持 ２０ 代 。 Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ 等 （ １９９５） 发 现 ， 在 复 合 培 养 基 和 基 本 培 养 基 中 ， 重 组 酿酒酵母的质粒稳定性和比生长速率的关系不同。 在葡萄糖限制的复合培养基中， 质粒丢失速率随稀 释率的增加而增大， 但是在葡萄糖限制的基本培养 基 中 则 相 反［３］。
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔｒａｔｅｇｙ
狭 义 的 基 因 工 程 即 重 组 ＤＮＡ 技 术 ， 其 基 本 过 程主要包括以下的 ５ 个方面： ｌ） 从供体细胞中分离 出 基 因 组 ＤＮＡ， 用 限 制 性 核 酸 内 切 酶 分 别 将 外 源 ＤＮＡ（ 包 括 外 源 基 因 组 和 目 的 基 因 ） 和 载 体 分 子 切 开 （ 简 称 切 ） ； ２） 用 ＤＮＡ 连 接 酶 将 含 有 外 源 基 因 的 ＤＮＡ 片 段 接 到 载 体 分 子 上 ， 形 成 ＤＮＡ 重 组 分 子 （ 简 称 接 ） ； ３） 借 助 于 细 胞 转 化 手 段 将 ＤＮＡ 重 组 分 子导入受体细胞中（ 简称转） ； ４） 短时间培养转化细 胞 ， 以 扩 增 ＤＮＡ 重 组 分 子 或 使 其 整 合 到 受 体 细 胞 的基因组中（ 简称增） ； ５） 筛选和鉴定转化细胞， 获 得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞 （ 简称检） 。作为现代生物工程的关键技术， 基因工 程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达， 基 因工程菌（ 细胞） 即是现代生物工程中的微型生物 反应器。
１ 质粒不稳定性的定义及类型
重组质粒的不稳定性， 是指重组菌在培养过程 中发生突变或丢失， 结果使重组菌失去了原有的表 型特征。依据重组质粒的变化本质， 质粒不稳定性 可 分 为 结 构 不 稳 定 性 、分 离 不 稳 定 性 。 质 粒 的 结 构 不 稳 定 主 要 是 由 于 ＤＮＡ 的 插 入 、 缺 失 或 重 排 等 引 起的不稳定， 使目的基因功能丢失， 但对质粒主要
Ｂｉｏｎ 和 Ｌｕｘｅｎ 报 道 ， 插 入 ＤＮＡ 片 断 的 大 小 ， 在 质 粒 分 离 不 稳 定 性 中 有 关 系 。他 们 酶 切 同 源 和 外 源 染 色 体 ＤＮＡ， 得 到 大 小 不 同 的 片 断 ， 与 穿 梭 质 粒 ｐｗＢ１１０ 重 组 。 得 到 两 个 重 组 质 粒 ｐＬＢ２ （ ３．６ｋｂ） 和 ｐＬＢ５（ ５．９ｋｂ） ， 转 入 枯 草 杆 菌 后 ， 重 组 质 粒 的 稳 定 性 表 现 出 和 插 入 ＤＮＡ 片 断 大 小 有 关 。 而 转 入 大 肠 杆 菌 ， 重 组 质 粒 却 不 表 现 出 这 种 相 关 性 ［３］。 赵 月 娥 等 对 人 ｔＰＡ 基 因 进 了 重 建 ， 保 留 了 Ｆ、Ｇ 和 Ｐ 区 并 引 入 突 变 ， 构 建 了 Ｋ１， Ｋ２ 区 缺 失 突 变 的 重 组 ｔＰＡ 质 粒 ｐＱＥ３０， 并 在 大 肠 杆 菌 ＪＭ１０９ 菌 株 中 成 功 表 达 。 从 理 论 上 分 析 与 实 验 数 据 均 显 示 ， 由 于 重 建 的 ｔＰＡｒ 基 因 的 ＤＮＡ 长 度 减 少 了 ４０％， 克 隆 并 导 入 宿 主 菌 后 ， 具 有 更 高 的 遗 传 稳 定 性［１２］。
关键词： 基因工程 重组质粒 稳定性 策略
Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｐｒ ｏｇｒ ｅｓｓ ｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｘｉａｏ Ｓｈｕｏ Ｈｏｎｇ Ｈｕａｚｈｕ Ｐｅｎｇ Ｊｉａｎｘｉｎ
（ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７９）
收稿日期： ２００７－１２－１７ 作者简介： 肖硕（ １９７４－） ， 女， 主管药师， 在读研究生， 研究方向： 农业害虫与生物防治 通讯作者： 洪华珠， 电子信箱： ｈｚｈｏｎｇ＠ｍａｉｌ．ｃｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１０
生物技术通报 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００８ 年第 ４ 期
ｐａｒＤＥ 基 因 的 插 入 ， 可 提 高 重 组 质 粒 稳 定 性 。 莫 志 伟 等 将 ｐａｒＤＥ 基 因 插 入 到 ｐＳＴ１０２１ 等 质 粒 上 可以提高重组质粒的遗传稳定性， 提高基因工程菌 的 应 用 效 果［１０］。赵 立 平 等 也 利 用 ＲＫ２ 质 粒稳定 性 ［１１］。 ３．３ 选择适当的宿主细胞
２ 质粒不稳定性的影响因素 ２．１ 宿主细胞的遗传特性
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞 遗传特性的影响。相对而言， 重组质粒在大肠杆菌 中比较稳定， 在枯草杆菌和酵母中较不稳定， 但是 也 有 例 外 。黄 立 志 等 发 现 外 源 ＮＫ 基 因 的 导 入 对 宿 主 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ 与 ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ＧＳ１１５ＤＥ 生 长 没 有 明 显 影 响 ， 重 组 质 粒 Ｐｂｖ２２０－ＮＫ 在 大 肠 杆 菌 中 结 构 稳 定 性 有 待 提 高 ， 而 在 毕 赤 酵 母 中 稳 定 性 很 好［４］。 ２．２ 质粒的特性
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｓｕｂｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｏｎｅ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｐａｒｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｓｔｅａｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ ｔｈｅ ｈａｒｄ ｃｏｒｅ ｓｔｅｐ ａｎｄ ｆｉｎａｌ ａｉｍ． Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｉｔｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ， ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ， ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．