内毒素光度测定法检查技术

2. 内毒素浓度越高，反应期曲线越陡；
3.
C3
内毒素浓度越高，进入结束期越快。
C2
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T（分）
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光度测定法BET试验的相关变量
Rt（%）
100 C1
C3 C2
相关变量： 内毒素浓度(C) 透光度(Rt或OD) 反应时间(T)
Rt%
LgT
100
92
预设透光度值R0
T3
回归分析
LgT=b-kLgC
C2 C1
T2
C3
T1
T1
T2
T3
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T(分)
C3
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C2
C1
LgC
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（2）测定样品内毒素浓度（Cs）
• 用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品(S)反应，得到反应时间Ts， 比对C-T关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cs。
入射光
反应混合物 I
透射光
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光电池
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I Is It
Ie T(分)
• 设：初始时的透光强度为Is，某时刻的透光强度为It 定义1：透光度（Rt）： Rt=It/Is(%) 初始时It=Is，Rt=100%，Rt曲线变化趋势是由高至低。 定义2： 吸光度(OD)：
Rt(%) 92
LgT
R0
比对标准曲线 Ts
LgT=b-kLgC
Ts
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Cs
T(分)
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Cs
LgC
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2）终点法原理
百度文库
• 固定反应时间（T），建立内毒素浓度与透光度关系的标准曲线（C-Rt曲 线），用供试品的透光度比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。
– 制造商：美国伯腾公司（BioTek） – 功能强大的细菌内毒素检测仪器
细菌内毒素检测 药物筛选 ELISA分析 酶分析
– 丰富的面板操作及数据分析，无需电脑可独立操作 – 可使用多个波长同时分析
Rx，比对C-Rt关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cx。
Rt(%)
Rt(%)
Rt=b-K·C
100 Rx
比对标准曲线
Rx
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Cx
To
T(分)
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Cx
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3、动态比浊法
• 试验仪器及器具
– 动态微孔平板仪或试管仪 – BET软件 – 微孔平板、反应试管等
T（分）
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1）动态法原理
• 固定透光度(Rt)，建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线（C-T曲线） ，用供试品的反应时间比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。这里的
反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值（Rt）的时间。
（1）建立标准曲线
内毒素光度测定法检查技术
• 1、光度测定法方法学分类 • 2、光度测定法原理 • 3、动态比浊法BET • 4、终点比色法BET
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1、光度测定法方法学分类
光度测定法
（定量法检测）
浊度法
(比浊法)
显色法
(比色法)
动态浊度法 终点浊度法 动态显色法 终点显色法
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美国Charles River Endosafe 便携式检测系统（PTS）
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• LKM细菌内毒素动态试管仪
– 制造商：英国莱伯金耐特公司（Lab Kinetics Ltd.）
– 世界上第一台动态试管仪的生产商
– 目前世界上销量最大的动态试管仪
– 已经取得医疗器械许可证
仪器特点：
1、体积小巧，占用空间小；
– 完善的售后服务
2、恒温性能、光学性能精密，
各孔温度均在37±0.2℃，
这是国内同类仪器无法达
到的。
3、配有专业的、操作简单的软
件系统。
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• ELx808IU型动态酶标仪
（1）建立标准曲线
Rt(%)
100
预设反应终止时间T0
Rt
R3
回归分析
R2
R3
Rt=b-K·C
R2
R1
C3
C1
C2
R1
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T(分)
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C3
C2
C1
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（2）测定样品内毒素浓度（Cx）
• 用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品（X）反应，得到透光度值
OD= -lg(It/Is) 初始时It=Is，OD=0，OD曲线变化趋势是由低至升高。 • 选择不同的参数(Rt或OD)将得到不同变化趋势的动态曲线。
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TAL与内毒素反应的动态曲线(Rt-T曲线)
• 以透光度（Rt）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引 起反应混合液透光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动
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2、光度测定法原理
• 光电转换原理
– 光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光 度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。
– 当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流I，我 们称I为透光强度。
透光容器
OD
动态曲线
0
孕育期
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反应期
结束
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T（分）
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动态曲线的特点
• 把标准内毒素制备成三个浓度C1、C2、C3（ C1>C2>C3 ），分别 与TAL反应，描绘出反应的动态曲线如下图：
Rt（%）
C1
分析动态曲线可看出：
1. 内毒素浓度越高，孕育期越短；
态曲线如图：
Rt（%）
100
动态曲线
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孕育期
反应期
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结束
T（分）
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TAL与内毒素反应的动态曲线(OD-T曲线)
• 以吸光度（OD）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应 引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的 动态曲线如图：
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湛江安度斯公司开发的BET专用软件 “生物探针-2002”
英国Lab Kinetics公司 ATi动态试管仪, 96孔
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美国 BioTek公司超级酶标仪， ELx808IU,使用96孔微孔板