20041130_安捷伦HPLC色谱柱选择与色谱柱维护保养
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4
7
6
6
0 5 10 Time (min) 1. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 色谱柱: ZORBAX Extend-C18 3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4.6 x 150 mm, 5 mm 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2 流动相: 30% 缓冲液: 70% 待测物pKa+1.5以外 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 MeOH pH 7 缓冲液20 mM 的流动相pH Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 可保证方法的稳定性 TEA 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0 0 5
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为 重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW 4, 样品 MW > 4, 000, 000, 选择 80Å 的孔径 选择 300Å 的孔径
粒径
• 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积
• 颗粒外表面和内部孔表面的总和,
示
以m2/gram表
孔径
• 颗粒的孔或腔的平均尺寸,
范围80-300Å
Agilent Technologies
8页
C-18柱---性能影响因素
色谱柱化学性质
键合类型
• 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
键合类型 --- 对色谱分离的影响
单齿键合： 提高传质速率, 双齿键合： 加快色谱柱平衡
CH 3 O Si CH 3 CH 3 3 O Si CH CH 3 CH3 O Si CH 3 CH 3 O Si CH 3 CH 3 CH 3 O Si CH3
OSi
OSi
增加色谱柱稳定性, 量
增加色谱柱的载样
4
5
6
pH 7.25
0 1
2
67
3
2
3 Time (min)
4
5
6
• 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 —甚至很小的 0.05–0.25 个pH变化单位.
Agilent Technologies
23页
液相柱---保留值与pH的关系
pH变化： 0.2个pH(7.0~7.2) 保留时间改变： 1.2分钟 (13.6~14.8分钟)
Agilent Technologies
14页
大孔径填料适用于大分子分析
* * 大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
Fe 3 21 76
Zr nd 88
Cu nd
Cr nd
Zn 1 88
< 1 nd
N/ A N/ A nd
130 57
nd N/ A N/ A nd
2900 N/ A 40
65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质,
11页
• 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
Agilent Technologies
12页
C-18柱---性能影响因素
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时 , 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
Agilent Technologies
19页
传统键合及封端技术
CH 3 OH OH OH OH
R = C8, C18,etc.
CH3 O CH 3 OH Si R CH 3
O CH3
Si R
+
OH CH3 OH CH 3 O Si R CH 3
Cl Si R CH 3
+
CH3
CH3 CH 3
Cl Si CH 3 CH 3
250oC
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx
多孔硅胶微球
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
Agilent Technologies
C-18柱---性能影响因素
色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 柱压低 运行时间长
HO OCH 3 O O OCH 3 CH 2 CH 2 O H 3C O HO 3 O O O H
分子量虽小但 hydrodynamic volum (水动力学体积)较大的分子
N CH 3 O CH 3 O HO CH 3 O H CH 3
SB-C3 (80Å)
Pw 1/2 = 0.442
CH 3
Agilent Technologies
16页
300Å 孔径可改善大分子的峰形
色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸 O 流速: 0.75 mL/min CH 3 CHO 温度: RT CH H 2 3C 检测器: UV 282 nm HC
Bonus-RP pH 2~9
Eclipse XDB C18 pH 2~9
StableBond C18 pH 1~8
Agilent Technologies
26页
复杂组分的流动相pH选择技巧
Extend-C18 高pH下, pH 7
4 2, 1 1 5 5 2 3 7 3
碱性成分的保留增加
Extend-C18 pH 11
样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol 7. ibuprofen
pH 7.00
0 1
1
2
4
5
7 3
6
0.25 个pH
2 1
3 Time (min) 4 5
Tylosin(泰乐菌素) MW. 926
300SB-C3 (300Å)
Pw 1/2 =0.125
0
5 Time (min)
10
0
5 Time (min)
10
• 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 • 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍
Agilent Technologies
17页
C-18柱---性能影响因素
保留时间随pH 改变不明显
保留时间随pH改变 不明显(酸性环境中)
Agilent Technologies
24页
液相柱---保留值与pH的关系
方法稳定区
中性组份 酸性组份
方法波动区(pKa+1.5)
方法稳定区
碱性组份
Agilent Technologies
25页
液相柱---保留值与pH的关系
Extend C18 pH 2~11.5
<1ppm); 99.995% 纯度的二氧化
Agilent Technologies
ZORBAX®生产工艺
• StableBond • Eclipse XDB • Bonus-RP • Extend
硅胶 + 脲 (pH=2) + 甲醛 CH2O
10页
D O2
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 物理性质
6页
•颗粒形状
•粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率 •封端
Agilent Technologies
7页
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
• 球型或不规则型
Agilent Technologies
15页
300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
孔径,
选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得 最佳峰形
0.20 0.18
0.16 0.14
分子量对峰宽的影响(梯度分离)
300SB-C18 (300Å) SB-C18 (80Å)
PW 1/2
0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0
Agilent Technologies
21页
液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm, 5um 部件号：880975-906 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH 2.5 & 2.6 温度：500C 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
(TMS)
O Si CH 3
O Si R
固定相键合 二甲基硅烷
封端 四甲基硅烷
Agilent Technologies
20页
安捷伦专利的空间位阻保护
取代基：五个 旁侧基团: 异丙基
键合相 流失, 保留减弱
另一个裸露的硅羟基 ,
潜在的拖尾因素
普通硅胶柱低 pH <2 不稳定, 发生水解
Zorbax StableBond 空间位阻保护---抗水解能力
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
Na 10 17 56
K <3 nd
金属浓度（ppm) Mg Al Ca Ti 4 nd 1.5 57 300 2 9 38 nd 32
正相 &反相色谱
正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相 固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
4页
反相分配色谱
极性:固定相 < 流动相
固定相 - 非极性
流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
Agilent Technologies
柱填料基质
分子量<2, 000 溶于四氢呋喃 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式 溶于水
非离子化
抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式
样品
离子化
用硅胶的正相模式 离子交换模式 溶于有机溶剂 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
分子量>2, 000
溶于水
大孔填料的离子交换模式
用大孔填料的反相模式
Agilent Technologies
RS变化值 1.6
Agilent Technologies
22页
液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm, 3.5 µm 流动相: 44% 25 mM磷酸, pH 7.00 : 56% 甲醇 流速: 1.0 mL/min 温度: 25°C 检测: UV 250 nm
安捷伦科技
Sa
1页
HPLC色谱柱选择与维护保养
Agilent Technologies
2页
安捷伦HPLC色谱柱选择
Agilent Technologies
分离模式的选择
溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水 溶于有机溶剂
3页
用硅胶的正相模式
用键合相的正相模式 用键合相的反相模式
用键合相的反相模式
O Si
Si O
Agilent Technologies
18页
C-18柱---性能影响因素
碳覆盖率--- 对色谱分离的影响
高碳覆盖率：提高分辨率, 分析时间长 低碳覆盖率：缩短运行时间
封端 --- 对色谱分离的影响
封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸 性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品, 未封端与经过封端处理的 色谱柱在选择性上有明显差异
碳覆盖率
• 与基体物质相连的键合相的量
封端
来
• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起
Agilent Technologies
9页
C-18柱---性能影响因素
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
高或低pH下, 硅胶会溶解 化学修饰困难
5页
• 硅胶基质- pH 3~8 • Al2O3 . nH2O - pH1~14 - pH1~14
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有 • 聚合物基质 机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
Agilent Technologies
C-18柱---性能影响因素
粒径源自文库--- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
球形
不规则形
1.8µm
3.5µm
5µm
Agilent Technologies
7µm
13页
C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响
7
6
6
0 5 10 Time (min) 1. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 色谱柱: ZORBAX Extend-C18 3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4.6 x 150 mm, 5 mm 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2 流动相: 30% 缓冲液: 70% 待测物pKa+1.5以外 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 MeOH pH 7 缓冲液20 mM 的流动相pH Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 可保证方法的稳定性 TEA 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0 0 5
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为 重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW 4, 样品 MW > 4, 000, 000, 选择 80Å 的孔径 选择 300Å 的孔径
粒径
• 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积
• 颗粒外表面和内部孔表面的总和,
示
以m2/gram表
孔径
• 颗粒的孔或腔的平均尺寸,
范围80-300Å
Agilent Technologies
8页
C-18柱---性能影响因素
色谱柱化学性质
键合类型
• 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
键合类型 --- 对色谱分离的影响
单齿键合： 提高传质速率, 双齿键合： 加快色谱柱平衡
CH 3 O Si CH 3 CH 3 3 O Si CH CH 3 CH3 O Si CH 3 CH 3 O Si CH 3 CH 3 CH 3 O Si CH3
OSi
OSi
增加色谱柱稳定性, 量
增加色谱柱的载样
4
5
6
pH 7.25
0 1
2
67
3
2
3 Time (min)
4
5
6
• 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 —甚至很小的 0.05–0.25 个pH变化单位.
Agilent Technologies
23页
液相柱---保留值与pH的关系
pH变化： 0.2个pH(7.0~7.2) 保留时间改变： 1.2分钟 (13.6~14.8分钟)
Agilent Technologies
14页
大孔径填料适用于大分子分析
* * 大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
Fe 3 21 76
Zr nd 88
Cu nd
Cr nd
Zn 1 88
< 1 nd
N/ A N/ A nd
130 57
nd N/ A N/ A nd
2900 N/ A 40
65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质,
11页
• 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
Agilent Technologies
12页
C-18柱---性能影响因素
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时 , 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
Agilent Technologies
19页
传统键合及封端技术
CH 3 OH OH OH OH
R = C8, C18,etc.
CH3 O CH 3 OH Si R CH 3
O CH3
Si R
+
OH CH3 OH CH 3 O Si R CH 3
Cl Si R CH 3
+
CH3
CH3 CH 3
Cl Si CH 3 CH 3
250oC
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx
多孔硅胶微球
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
Agilent Technologies
C-18柱---性能影响因素
色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 柱压低 运行时间长
HO OCH 3 O O OCH 3 CH 2 CH 2 O H 3C O HO 3 O O O H
分子量虽小但 hydrodynamic volum (水动力学体积)较大的分子
N CH 3 O CH 3 O HO CH 3 O H CH 3
SB-C3 (80Å)
Pw 1/2 = 0.442
CH 3
Agilent Technologies
16页
300Å 孔径可改善大分子的峰形
色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸 O 流速: 0.75 mL/min CH 3 CHO 温度: RT CH H 2 3C 检测器: UV 282 nm HC
Bonus-RP pH 2~9
Eclipse XDB C18 pH 2~9
StableBond C18 pH 1~8
Agilent Technologies
26页
复杂组分的流动相pH选择技巧
Extend-C18 高pH下, pH 7
4 2, 1 1 5 5 2 3 7 3
碱性成分的保留增加
Extend-C18 pH 11
样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol 7. ibuprofen
pH 7.00
0 1
1
2
4
5
7 3
6
0.25 个pH
2 1
3 Time (min) 4 5
Tylosin(泰乐菌素) MW. 926
300SB-C3 (300Å)
Pw 1/2 =0.125
0
5 Time (min)
10
0
5 Time (min)
10
• 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 • 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍
Agilent Technologies
17页
C-18柱---性能影响因素
保留时间随pH 改变不明显
保留时间随pH改变 不明显(酸性环境中)
Agilent Technologies
24页
液相柱---保留值与pH的关系
方法稳定区
中性组份 酸性组份
方法波动区(pKa+1.5)
方法稳定区
碱性组份
Agilent Technologies
25页
液相柱---保留值与pH的关系
Extend C18 pH 2~11.5
<1ppm); 99.995% 纯度的二氧化
Agilent Technologies
ZORBAX®生产工艺
• StableBond • Eclipse XDB • Bonus-RP • Extend
硅胶 + 脲 (pH=2) + 甲醛 CH2O
10页
D O2
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 物理性质
6页
•颗粒形状
•粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率 •封端
Agilent Technologies
7页
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
• 球型或不规则型
Agilent Technologies
15页
300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
孔径,
选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得 最佳峰形
0.20 0.18
0.16 0.14
分子量对峰宽的影响(梯度分离)
300SB-C18 (300Å) SB-C18 (80Å)
PW 1/2
0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0
Agilent Technologies
21页
液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm, 5um 部件号：880975-906 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH 2.5 & 2.6 温度：500C 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
(TMS)
O Si CH 3
O Si R
固定相键合 二甲基硅烷
封端 四甲基硅烷
Agilent Technologies
20页
安捷伦专利的空间位阻保护
取代基：五个 旁侧基团: 异丙基
键合相 流失, 保留减弱
另一个裸露的硅羟基 ,
潜在的拖尾因素
普通硅胶柱低 pH <2 不稳定, 发生水解
Zorbax StableBond 空间位阻保护---抗水解能力
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
Na 10 17 56
K <3 nd
金属浓度（ppm) Mg Al Ca Ti 4 nd 1.5 57 300 2 9 38 nd 32
正相 &反相色谱
正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相 固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
4页
反相分配色谱
极性:固定相 < 流动相
固定相 - 非极性
流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
Agilent Technologies
柱填料基质
分子量<2, 000 溶于四氢呋喃 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式 溶于水
非离子化
抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式
样品
离子化
用硅胶的正相模式 离子交换模式 溶于有机溶剂 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
分子量>2, 000
溶于水
大孔填料的离子交换模式
用大孔填料的反相模式
Agilent Technologies
RS变化值 1.6
Agilent Technologies
22页
液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm, 3.5 µm 流动相: 44% 25 mM磷酸, pH 7.00 : 56% 甲醇 流速: 1.0 mL/min 温度: 25°C 检测: UV 250 nm
安捷伦科技
Sa
1页
HPLC色谱柱选择与维护保养
Agilent Technologies
2页
安捷伦HPLC色谱柱选择
Agilent Technologies
分离模式的选择
溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水 溶于有机溶剂
3页
用硅胶的正相模式
用键合相的正相模式 用键合相的反相模式
用键合相的反相模式
O Si
Si O
Agilent Technologies
18页
C-18柱---性能影响因素
碳覆盖率--- 对色谱分离的影响
高碳覆盖率：提高分辨率, 分析时间长 低碳覆盖率：缩短运行时间
封端 --- 对色谱分离的影响
封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸 性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品, 未封端与经过封端处理的 色谱柱在选择性上有明显差异
碳覆盖率
• 与基体物质相连的键合相的量
封端
来
• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起
Agilent Technologies
9页
C-18柱---性能影响因素
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
高或低pH下, 硅胶会溶解 化学修饰困难
5页
• 硅胶基质- pH 3~8 • Al2O3 . nH2O - pH1~14 - pH1~14
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有 • 聚合物基质 机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
Agilent Technologies
C-18柱---性能影响因素
粒径源自文库--- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
球形
不规则形
1.8µm
3.5µm
5µm
Agilent Technologies
7µm
13页
C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响