色谱分析(中国药科大学)超高效液相色谱(UPLC)

超高效液相色谱(UPLC)
超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。

在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。

基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。

它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7µm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。

这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。

世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。

图1：填料技术的沿革
1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础
液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。

颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。

由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分
离度不断提高。

事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。

Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。

Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。

由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。

还应该注意到1.7 µm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。

小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。

然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。

小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。

在利用杂化颗粒技术合成出耐压的新一代小颗粒色谱填料之后，UPLC超高效液相色谱系统的设计，充分利用了小颗粒填料的所有优点，弥补传统HPLC系统的不足。

图2: 范德米特(van Deemeter)曲线
1.1 超高分离度
根据等度液相色谱分离的分离度(Rs)方程，分离度(Rs)与柱效(N)的平方根成正
比。

N 4
)(α－1α)k 2(k 2+1)(1)
按Van Deemter 色谱理论，柱效(N)与颗粒度(dp)成反比：
L dp ∝N (2)
故：随着dp 的降低，N 值会增加；而N 值增加，则Rs 值增加。

HPLC 与UPLC
的基本分离理论，进一步说明了颗粒度大小和分离度密不可分的关系。

新一代UPLC系统发挥了1.7 µm颗粒提供柱效增高的全部优越性。

尤其是1.7 µm颗粒提供的柱效比5 µm颗粒提高了3倍。

因为分离度与粒度的平方根成反比，1.7 µm颗粒的分离度比5 µm颗粒提高了70％。

在梯度分离中也具有同样的优越性，此时分离能力用峰容量衡量。

UPLC用1.7 µm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰（见图3），从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。

而且又最大地缩短了开发方法所需的时间。

图3显示UPLC可以大大提高分离度，同时色谱峰强度也得到了提高。

图3: UPLC与HPLC：分离度比较
1. 2 超高速度
较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。

因为颗粒度减小后，柱长可以按比例缩短而保持柱效不变(见式3)，而且Van Deemter理论表明最佳流速
与粒度成反比(见式4)。

柱长缩短会加快分离速度，而颗粒度越小，最佳流速也越大，进而可以通过提高流速来进一步加快分离速度。

(3)
由于新一代UPLC 系统用1.7 µm 颗粒，柱长可以比用5 µm 颗粒时缩短3倍而
保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了9倍而分离度保持不变。

1.3 超高灵敏度
过去几年中，提高灵敏度的工作集中在检测器上，包括光学检测器和质谱检测
器。

这种趋势主要是受要求检测化合物的浓度越来越低（如高效药物）的驱动。

然而采用超高性能色谱系统就能获得灵敏度的显著提高。

在UPLC 中始终可得到较高的灵敏度。

UPLC 使用小颗粒技术可以得到更高的
柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽(见式5），即更高的灵敏度。

因为色谱峰变得更窄，峰高也就更高了(见式6)；同样，当UPLC 用于快速分析、
用较短色谱柱而使柱效不变时，色谱峰高会相应增加 (见式7)。

因此，使用UPLC 技术，不仅可以在保持与HPLC 相同分离度时提高峰高，而且在改善分离度的同时亦可提高峰高即灵敏度。

1
最佳流速∝ ——……..(4) dp 1 峰高∝——…..(6) W 1
峰高∝——……(7) L
图5: HPLC到UPLC：灵敏度的改善无需折衷
1.4 UPLC为最佳的质谱入口
UPLC与质谱联用，可以实质性地改善质谱检测结果的质量。

UPLC的特殊性能使质谱检测器的性能首次得以充分体现。

由于低流速下色谱峰扩散不大，增加了峰浓度，有利于提高离子源的效率，因而使灵敏度至少提高了3倍。

除UPLC技术本身带来的速度、灵敏度和分离度的改善外，UPLC的超强分离能力有助于待测物与同其竞争电离的杂质的分离，从而可以使质谱检测器的灵敏度因离子抑制现象的减弱或克服而得到进一步的提高。

故使用UPLC－MS联用，可以获得灵敏度较HPLC－MS联用系统大有改善的分离结果，获得更多、质量更好的信息。

图6: HPLC-MS到UPLC-MS：灵敏度的额外提高
1.5简单方便的方法转换
UPLC与HPLC基于相同的分离机理，故相互之间的方法转换非常容易和方便。

现有HPLC方法可以按照比例直接转换成UPLC方法；相反，UPLC方法也很容易可以转换成HPLC方法供常规HPLC系统使用。

UPLC不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。

使用UPLC可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。

2 UPLC的创新和技术基础1
高柱效的UPLC色谱柱是UPLC技术中最重要的部分。

新一代应用“杂化颗粒技术”（Hybrid particle technology，HPT）研制的桥式乙烷－硅碳杂化颗粒具有耐高压，宽pH使用范围（pH 2~12）的特点。

Waters公司为UPLC色谱柱装备了一台用独立柱塞驱动，能进行4种溶剂切换的二元高压梯度输液泵。

耐压可达16000psi，在这个压力下，溶剂尤其是梯度分离时使用的混合溶剂，其压缩性会有显著变化，因此溶剂输送系统可在很宽压力范围内，具有补偿溶剂压缩性变化的能力。

从而能在等度或者梯度条件下保持流速的稳定性和梯度的重现性。

在UPLC中为保护色谱柱不受极端高压力波动的影响，进样过程应当相对无压力波动；进样系统的死体积应足够小以降低样品谱带展宽；快速进样周期可以使得UPLC在具有高样品容量的同时也实现高速度，还具有极低交叉污染的小体积进样的能力。

Acquity UPLC TM采用的进样新技术包括：针内针进样探头（XYZZ’），它是一种高速进样机械装置，它是使用液相色谱管路（PEEK材料）充当进样针以减少死体积，而“外针”是一小段硬管，用来扎破样品瓶塞；压力辅助进样，采用一强一弱的双溶剂清洗进样针以降低进样时候的交叉污染。

UPLC对于检测器有两个要求：高的采样速度，使得它可以收集足够多的数据点，以获得准确，可重现的保留时间和峰面积；检测池的死体积要尽可能小，减少谱带扩展以保持高柱效。

Waters公司的Acquity UPLC TM使用采样速度为40点/s,池体积仅为500 nl(约为HPLC的1/20)的新型光导纤维传导的流通池。

当光束通过光导纤维传入流通池后，利用聚四氟乙烯池壁的全反射特征，不损失光能量，而使得检测灵敏度比HPLC高2~3倍。

光源可使用可变波长的紫外光或二极管阵列系统。

3 UPLC的缺陷
UPLC可以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，为用户节省宝贵的时间和日常溶剂消耗，从而获得最大的投资回报。

但是小颗粒填料在带来高柱效
高分离速度的同时也会引起高的反压，使得工作柱压比普通HPLC高许多，导致UPLC的色谱柱的寿命比较短，这就造成其使用成本过高。

4 UPLC的应用举例
居文政等（2）建立了用UPLC-MS法研究灯盏花乙素在胃肠道的代谢物的方法，确定了以总苷元为检测对象研究灯盏花乙素药代动力学是合理的。

参考文献
1 于士林高效液相色谱方法与应用（第二版）化学工业出版社185－194
2 居文政，储继红，谭仁祥等UPLC-MS/MS联用法分析灯盏花乙素在胃肠道的代
谢物[J]. 中国临床药理学与治疗学,2006；11(3):292-295。