通过扩增青霉素生物合成基因簇提高产黄青霉在固态和液态发酵中的
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• 利用整套基因簇来增加青霉素基因的拷贝数而不 是转入单个的pcbAB和pcbC-penDE基因。
• 为实现这一目标，用分别位于基因簇的两个末端 的探针pcbAB和penDE对基因组文库进行了筛选。 对E.coli进行的13次克隆证实这两个探针都已分离 出来并获得了粘性质粒DNA。
结果与讨论
• 以此方式形成的重组粘性质粒继续呈递进行 Southern分析，分析中仍然使用相同的两个探针 以确定它们包含整套的青霉素基因簇。其中一个 名为IztapaCos-pen5的粘性质粒（图2 第5列）， 被用于转化产黄青霉。
并包括基因pcbAB编码区的3’末端序列 和3’-UTR的起始序列
pbcAB探针
通过切口转移标记上α-32P-dCTP
penDE探针
【由HindIII酶切质粒pULJL33而获得】 大小为0.3kb ，包含基因penDE的3’ 末端序列
材料和方法
真菌的转化
碱裂解
E.coli
40kbp粘性质粒
30μg/ml 腐草霉素
•
追求至善凭技术开拓市场，凭管理增 创效益 ，凭服 务树立 形象。2020年10月20日星期 二上午12时40分32秒00:40:3220.10.20
•
严格把控质量关，让生产更加有保障 。2020年10月 上午12时40分20.10.2000:40October 20, 2020
•
作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2020年10月20日星期 二12时40分32秒00:40:3220 October 2020
材料和方法
固态发酵
经过0.3-0.6mm孔径筛过的甘蔗渣 改良的Somerson复合生产培养基
接种（ 2×106孢子/ml ）
初始的水分含量设定为70%
在每个Raimbault型圆柱发酵罐中加入12g固体培养基
25 oC条件下进行144小时，通气量设定为2.4L/h
取1克潮湿的培养 基样品测定其pH 值和青霉素含量
• 对原始和转化菌株的青霉素产量采用 Student’s T-test方法进行分析。
结果与讨论
• 在粘性质粒载体IztapaCos中构建了一个基因组文 库，该文库携带有一个腐草霉素抗性基因，且可 直接转入真菌之中，不需进一步的亚克隆。
• 首要目标——分离出一个含有整套青霉素基因簇 的粘性质粒克隆。
结果与讨论
• 另外，本实验首次显示基因剂量的增加对固态发 酵中次级代谢物产量的提高也同样适Βιβλιοθήκη Baidu。在这点 上，可以预见本实验中提出的策略在其最有效的 形式下，也可用于其它更适用于固态发酵的实验， 如Barrios-Gonza´lez et al. (1993a)和Ban˜os et al. (2007)描述的那些。
结果与讨论
• 如前所述，P2-32转化株在液态发酵和固态发酵中均比 Wis 54-1255转化株显示出更高的青霉素产量的增加（相 比于其亲本菌株）。对这些结果有种与生物合成基因无关 的解释。P2是一个不断经过突变和筛选而得的高青霉素产 量菌株。这意味着它已经积累了很多突变，而很多这些突 变在功能上与生物合成基因不同但可以互补（附属基因）， 比如更高的输出能力。很多这类基因已被描述（Kiel et al. 2005; Lamas-Maceiras et al. 2006; Garcı´a-Rico et al. 2008）。这些突变使得更高的青霉素生物合成潜能得到 更好地表达（由于生物合成基因的扩增）。因此，已存在 于菌株P2中的互补突变必定使得菌株对通过增加青霉素基 因簇拷贝数后获得的更高的生物合成潜能进行更高效的利 用。
转化菌株 的菌丝体
接种了枯草芽孢杆 菌的胰蛋白胨 （1%琼脂）培养 基中
材料和方法
液态发酵
接种 （1×106）
取各菌株的孢子
每隔一定时间，取5毫升培养物
转接
作为副本
含有50ml复合 生长培养基 25oC, 50rpm
培养36小时
含有45ml复合 生产培养基
25oC,
250rp m培 养144 小时
范文颖 • PPT制作及讲解：赵帅
谢谢
•
树立质量法制观念、提高全员质量意 识。20.10.2020.10.20Tuesday, October 20, 2020
•
人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。00:40:3200:40:3200:4010/20/2020 12:40:32 AM
•
安全象只弓，不拉它就松，要想保安 全，常 把弓弦 绷。20.10.2000:40:3200:40Oc t-2020- Oct-20
结果与讨论
• 高青霉素滴度产黄青霉工程菌内含有高拷贝的青霉素基因 簇，且此高拷贝以串联重复方式排列（Fierro et al. 1995; Newbert 1997）。到目前为止，通过转入额外青霉素基 因拷贝的方式增加青霉素产量的研究均是在含有单拷贝青 霉素基因簇的低产菌株上完成的（Veenstra et al. 1991; Theilgaard et al.2001）。我们首次使用了P2-32菌株， 据报道它含有多达14个拷贝的青霉素基因簇（Barredo et al. 1989）。Thykaer和Nielsen（2003）提出存在于一 株菌株内使产量增高的基因簇拷贝数有一个上限；他们指 出超过5个拷贝之后，基因簇拷贝数与青霉素产量之间不 再有线性关系。我们的实验结果显示即使是P2-32这种有 着高拷贝青霉素基因簇的菌株，也是对提高青霉素基因数 量的改进策略高度敏感的。
结果与讨论
• 这与实验结果相符，菌株Wis 54-1255比P2-32 更接近于野生型，其由于额外拷贝的转入而导致 的在固态发酵中产量的增加比P2-32更高。相反 地，对于菌株P2-32，额外拷贝的转入则在液态 发酵中起到更加显著的作用。显然，在Wis中更 加保守的“固态培养基因”促进了其新的生物合 成能力在固态发酵中的发挥，而这些基因在菌株 P2中没有很好地保留（或激活）。另一项试验结 果也可用相同的原理来解释，那就是Wis在固态 发酵和液态发酵（培养系统）间产量水平的差别 在TW转化株上更加显著，而这种差别在P2转化 株上则较小。
素G的产量 • 大肠杆菌DH5a——用于粘性质粒基因文库和一般基因操
作的受体
材料和方法
质粒载体
IztapaCos
cos区 多克隆位点
腐草霉素抗性基因位点 （基因ble）——作为 真菌选择标记 删除PstI和XbaI的限制 性酶切位点
材料和方法
基因组文库的构建
野生型 NRRL 1951
全部DNA
提取
通过扩增青霉素生物合成基因簇 提高产黄青霉在固态和液态发酵中的
青霉素产量 第二组 World J Microbiol Biotechnol (2008)
青霉素 杀菌
影响青霉素产量高低
次级代谢
随机突变
优化
基因工程
结构基因(pcbAB, pcbC和penDE) 基因过表达
构巢曲霉（Aspergillus nidulans）
• 同时利用在琼脂鞘上的发酵来检测所有转化菌株的青霉素 产量。检测中青霉素产量最高的菌株是对60μg/ml腐草霉 素有抗性的转化菌株。我们将此两种菌株中筛选出的青霉 素产量最高的转化菌株分别命名为TW和TP。
• 对液态发酵和固态发酵中TW和TP菌株的青霉素产量作了 仔细检测，并在同一实验中与其亲本菌株的发酵产量作了 比较。在亲本菌株内转入IztapaCos（空载体）作为对照， 该转化菌株的青霉素产量略微低于原菌株的青霉素产量。
结果与讨论
• 转化菌株Wis54-1255和P2-32被转移至腐草霉素浓度不断 增高的琼脂培养基上，以便选出含有高拷贝数的选择标记 基因ble的菌株，也就是含有高拷贝数青霉素基因簇的菌 株。转化菌株中的6株Wis54-1255和3株P2-32可以在含有 60μg/ml腐草霉素添加剂的培养基上生长。
Sau3A1部分消化 去磷酸化
连接
IztapaCos 载体
BamHIXbaI消化
材料和方法
基因组文库的筛选
30000cfu/dish 副本
于暗盒中在 -70oC条件 下用 HiperfilmMP胶片曝 光1小时
【通过PCR方法获得】 以TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT 和CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG 为引物，
•
加强交通建设管理，确保工程建设质 量。00:40:3200:40:3200:40Tuesday, October 20, 2020
•
安全在于心细，事故出在麻痹。20.10.2020.10.2000:40:3200:40:32October 20, 2020
•
踏实肯干，努力奋斗。2020年10月20 日上午1 2时40 分20.10. 2020.1 0.20
取出并混匀圆形容器中的内容物
1700rpm离心20分钟，青霉素被抽提到0.1M的磷酸缓冲液中 从值而）使。样 取品60的微p升H提值取为物5.或5（其如稀果释有物必用要于可生加物入鉴H定3P。O4调节pH
材料和方法
数据分析
• 对于固态和液态发酵实验，实验结果为两 个独立实验的平均值，样品（整个培养瓶 或圆柱发酵罐）为一式三份。
整个的 基因簇 pcbAB– pcbC– penDE
产黄青霉（Penicillium chrysogenum）
上述研究均是利用产黄青霉Wis54-1255完成的， Wis54-1255仅含有一个青霉素基因簇的拷贝并且只能 产生少量的抗菌素，而且实验结果只适用于液态发酵。
本实验中，研究者对比了在转入整个青霉素基因簇后 低产菌株（Wis54-1255）和高产菌株（P2-32）青霉 素产量的差别，并且首次应用此法检测转化菌株在新 兴的固态发酵（SSF）技术（Suryanarayan 2003; Barrios-Gonza´lezand Mejı´a 2007）中的反应。
材料和方法
菌株
• 产黄青霉Wis54-1255——青霉素低产菌株 • 产黄青霉Wis54-1255 npe10——其青霉素基因簇不完整 • 产黄青霉P2-32——青霉素高产菌株 可容纳青霉素基因簇以串联重复的方式扩增数倍 • 产黄青霉NRRL 1951（野生型）——用作基因文库的
DNA源 • 枯草芽孢杆菌ATCC 6633——用于在生物测定中评估青霉
• 综上，本试验结果表明，不论对低产或高产的菌 株，尽管后者已经含有高拷贝的青霉素基因簇，
扩增青霉素基因pcbAB-pcbC-penDE的数量均会
使菌株在液态发酵和固态发酵中的产量得到提高。
小组成员
• 组长：陈静 • 第一篇文献翻译：张蕊、邢跃、张倩、张
晶 • 第二篇文献翻译：周建平、郝雅男、陈静、
结果与讨论
• 相对于亲本菌株，转化菌株TW和TP的青霉素产量在两种 培养体系中均有显著提高。然而，来源于菌株P2-32的转 化菌株TP的青霉素产量则提高的更多。
结果与讨论
• 关于产黄青霉( P. chrysogenum )青霉素产量的早期研究表
明微生物在固态发酵中的生理生化反应与在液态发酵中的大 不相同，从而导致了它们在两种培养系统中产量水平的差异。 这一信息指出了设计能够特别适合于固态发酵菌株的改进方 法的必要性（Barrios-Gonza´lez et al. 1993a; BarriosGonza´lez and Mejı´a 2007）。研究表明越接近于野生型的 菌株在固态发酵能越高效地发挥其青霉素生产潜力，这说明 在遗传改良过程中，为适合液态发酵而开发的工业高产菌株， 正在失去一些（未知）有助于其在固体培养基上很好地适应 和生长的重要功能，（Barrios-Gonza´lez et al.1993a）。 寻找这些引起所谓的固体培养生理性的“固体培养基因”已 成为当前研究的主题（Barrios-Gonza´lez et al. 2008; Ishida et al. 2000; Te Biesebeke et al. 2005）。
Wis 54-1255 转 化 P2-32
筛
选
Wis 54-1255 npe10
30μg/ml 腐草霉素
转化菌株
转化菌株
30μg/ml腐草霉素
30–80μg/ml的梯度培养基
对照
30–80μg/ml的梯度培养基
材料和方法
青霉素在琼脂上的产量
Somerson培养基制成的琼 脂块
（g/l,乳糖110，葡萄糖14， CaCO3 20，KH2PO4 6， MgSO4•7H2O 6，谷物浸提液 70，苯乙酸1.4）
• 为实现这一目标，用分别位于基因簇的两个末端 的探针pcbAB和penDE对基因组文库进行了筛选。 对E.coli进行的13次克隆证实这两个探针都已分离 出来并获得了粘性质粒DNA。
结果与讨论
• 以此方式形成的重组粘性质粒继续呈递进行 Southern分析，分析中仍然使用相同的两个探针 以确定它们包含整套的青霉素基因簇。其中一个 名为IztapaCos-pen5的粘性质粒（图2 第5列）， 被用于转化产黄青霉。
并包括基因pcbAB编码区的3’末端序列 和3’-UTR的起始序列
pbcAB探针
通过切口转移标记上α-32P-dCTP
penDE探针
【由HindIII酶切质粒pULJL33而获得】 大小为0.3kb ，包含基因penDE的3’ 末端序列
材料和方法
真菌的转化
碱裂解
E.coli
40kbp粘性质粒
30μg/ml 腐草霉素
•
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作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2020年10月20日星期 二12时40分32秒00:40:3220 October 2020
材料和方法
固态发酵
经过0.3-0.6mm孔径筛过的甘蔗渣 改良的Somerson复合生产培养基
接种（ 2×106孢子/ml ）
初始的水分含量设定为70%
在每个Raimbault型圆柱发酵罐中加入12g固体培养基
25 oC条件下进行144小时，通气量设定为2.4L/h
取1克潮湿的培养 基样品测定其pH 值和青霉素含量
• 对原始和转化菌株的青霉素产量采用 Student’s T-test方法进行分析。
结果与讨论
• 在粘性质粒载体IztapaCos中构建了一个基因组文 库，该文库携带有一个腐草霉素抗性基因，且可 直接转入真菌之中，不需进一步的亚克隆。
• 首要目标——分离出一个含有整套青霉素基因簇 的粘性质粒克隆。
结果与讨论
• 另外，本实验首次显示基因剂量的增加对固态发 酵中次级代谢物产量的提高也同样适Βιβλιοθήκη Baidu。在这点 上，可以预见本实验中提出的策略在其最有效的 形式下，也可用于其它更适用于固态发酵的实验， 如Barrios-Gonza´lez et al. (1993a)和Ban˜os et al. (2007)描述的那些。
结果与讨论
• 如前所述，P2-32转化株在液态发酵和固态发酵中均比 Wis 54-1255转化株显示出更高的青霉素产量的增加（相 比于其亲本菌株）。对这些结果有种与生物合成基因无关 的解释。P2是一个不断经过突变和筛选而得的高青霉素产 量菌株。这意味着它已经积累了很多突变，而很多这些突 变在功能上与生物合成基因不同但可以互补（附属基因）， 比如更高的输出能力。很多这类基因已被描述（Kiel et al. 2005; Lamas-Maceiras et al. 2006; Garcı´a-Rico et al. 2008）。这些突变使得更高的青霉素生物合成潜能得到 更好地表达（由于生物合成基因的扩增）。因此，已存在 于菌株P2中的互补突变必定使得菌株对通过增加青霉素基 因簇拷贝数后获得的更高的生物合成潜能进行更高效的利 用。
转化菌株 的菌丝体
接种了枯草芽孢杆 菌的胰蛋白胨 （1%琼脂）培养 基中
材料和方法
液态发酵
接种 （1×106）
取各菌株的孢子
每隔一定时间，取5毫升培养物
转接
作为副本
含有50ml复合 生长培养基 25oC, 50rpm
培养36小时
含有45ml复合 生产培养基
25oC,
250rp m培 养144 小时
范文颖 • PPT制作及讲解：赵帅
谢谢
•
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结果与讨论
• 高青霉素滴度产黄青霉工程菌内含有高拷贝的青霉素基因 簇，且此高拷贝以串联重复方式排列（Fierro et al. 1995; Newbert 1997）。到目前为止，通过转入额外青霉素基 因拷贝的方式增加青霉素产量的研究均是在含有单拷贝青 霉素基因簇的低产菌株上完成的（Veenstra et al. 1991; Theilgaard et al.2001）。我们首次使用了P2-32菌株， 据报道它含有多达14个拷贝的青霉素基因簇（Barredo et al. 1989）。Thykaer和Nielsen（2003）提出存在于一 株菌株内使产量增高的基因簇拷贝数有一个上限；他们指 出超过5个拷贝之后，基因簇拷贝数与青霉素产量之间不 再有线性关系。我们的实验结果显示即使是P2-32这种有 着高拷贝青霉素基因簇的菌株，也是对提高青霉素基因数 量的改进策略高度敏感的。
结果与讨论
• 这与实验结果相符，菌株Wis 54-1255比P2-32 更接近于野生型，其由于额外拷贝的转入而导致 的在固态发酵中产量的增加比P2-32更高。相反 地，对于菌株P2-32，额外拷贝的转入则在液态 发酵中起到更加显著的作用。显然，在Wis中更 加保守的“固态培养基因”促进了其新的生物合 成能力在固态发酵中的发挥，而这些基因在菌株 P2中没有很好地保留（或激活）。另一项试验结 果也可用相同的原理来解释，那就是Wis在固态 发酵和液态发酵（培养系统）间产量水平的差别 在TW转化株上更加显著，而这种差别在P2转化 株上则较小。
素G的产量 • 大肠杆菌DH5a——用于粘性质粒基因文库和一般基因操
作的受体
材料和方法
质粒载体
IztapaCos
cos区 多克隆位点
腐草霉素抗性基因位点 （基因ble）——作为 真菌选择标记 删除PstI和XbaI的限制 性酶切位点
材料和方法
基因组文库的构建
野生型 NRRL 1951
全部DNA
提取
通过扩增青霉素生物合成基因簇 提高产黄青霉在固态和液态发酵中的
青霉素产量 第二组 World J Microbiol Biotechnol (2008)
青霉素 杀菌
影响青霉素产量高低
次级代谢
随机突变
优化
基因工程
结构基因(pcbAB, pcbC和penDE) 基因过表达
构巢曲霉（Aspergillus nidulans）
• 同时利用在琼脂鞘上的发酵来检测所有转化菌株的青霉素 产量。检测中青霉素产量最高的菌株是对60μg/ml腐草霉 素有抗性的转化菌株。我们将此两种菌株中筛选出的青霉 素产量最高的转化菌株分别命名为TW和TP。
• 对液态发酵和固态发酵中TW和TP菌株的青霉素产量作了 仔细检测，并在同一实验中与其亲本菌株的发酵产量作了 比较。在亲本菌株内转入IztapaCos（空载体）作为对照， 该转化菌株的青霉素产量略微低于原菌株的青霉素产量。
结果与讨论
• 转化菌株Wis54-1255和P2-32被转移至腐草霉素浓度不断 增高的琼脂培养基上，以便选出含有高拷贝数的选择标记 基因ble的菌株，也就是含有高拷贝数青霉素基因簇的菌 株。转化菌株中的6株Wis54-1255和3株P2-32可以在含有 60μg/ml腐草霉素添加剂的培养基上生长。
Sau3A1部分消化 去磷酸化
连接
IztapaCos 载体
BamHIXbaI消化
材料和方法
基因组文库的筛选
30000cfu/dish 副本
于暗盒中在 -70oC条件 下用 HiperfilmMP胶片曝 光1小时
【通过PCR方法获得】 以TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT 和CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG 为引物，
•
加强交通建设管理，确保工程建设质 量。00:40:3200:40:3200:40Tuesday, October 20, 2020
•
安全在于心细，事故出在麻痹。20.10.2020.10.2000:40:3200:40:32October 20, 2020
•
踏实肯干，努力奋斗。2020年10月20 日上午1 2时40 分20.10. 2020.1 0.20
取出并混匀圆形容器中的内容物
1700rpm离心20分钟，青霉素被抽提到0.1M的磷酸缓冲液中 从值而）使。样 取品60的微p升H提值取为物5.或5（其如稀果释有物必用要于可生加物入鉴H定3P。O4调节pH
材料和方法
数据分析
• 对于固态和液态发酵实验，实验结果为两 个独立实验的平均值，样品（整个培养瓶 或圆柱发酵罐）为一式三份。
整个的 基因簇 pcbAB– pcbC– penDE
产黄青霉（Penicillium chrysogenum）
上述研究均是利用产黄青霉Wis54-1255完成的， Wis54-1255仅含有一个青霉素基因簇的拷贝并且只能 产生少量的抗菌素，而且实验结果只适用于液态发酵。
本实验中，研究者对比了在转入整个青霉素基因簇后 低产菌株（Wis54-1255）和高产菌株（P2-32）青霉 素产量的差别，并且首次应用此法检测转化菌株在新 兴的固态发酵（SSF）技术（Suryanarayan 2003; Barrios-Gonza´lezand Mejı´a 2007）中的反应。
材料和方法
菌株
• 产黄青霉Wis54-1255——青霉素低产菌株 • 产黄青霉Wis54-1255 npe10——其青霉素基因簇不完整 • 产黄青霉P2-32——青霉素高产菌株 可容纳青霉素基因簇以串联重复的方式扩增数倍 • 产黄青霉NRRL 1951（野生型）——用作基因文库的
DNA源 • 枯草芽孢杆菌ATCC 6633——用于在生物测定中评估青霉
• 综上，本试验结果表明，不论对低产或高产的菌 株，尽管后者已经含有高拷贝的青霉素基因簇，
扩增青霉素基因pcbAB-pcbC-penDE的数量均会
使菌株在液态发酵和固态发酵中的产量得到提高。
小组成员
• 组长：陈静 • 第一篇文献翻译：张蕊、邢跃、张倩、张
晶 • 第二篇文献翻译：周建平、郝雅男、陈静、
结果与讨论
• 相对于亲本菌株，转化菌株TW和TP的青霉素产量在两种 培养体系中均有显著提高。然而，来源于菌株P2-32的转 化菌株TP的青霉素产量则提高的更多。
结果与讨论
• 关于产黄青霉( P. chrysogenum )青霉素产量的早期研究表
明微生物在固态发酵中的生理生化反应与在液态发酵中的大 不相同，从而导致了它们在两种培养系统中产量水平的差异。 这一信息指出了设计能够特别适合于固态发酵菌株的改进方 法的必要性（Barrios-Gonza´lez et al. 1993a; BarriosGonza´lez and Mejı´a 2007）。研究表明越接近于野生型的 菌株在固态发酵能越高效地发挥其青霉素生产潜力，这说明 在遗传改良过程中，为适合液态发酵而开发的工业高产菌株， 正在失去一些（未知）有助于其在固体培养基上很好地适应 和生长的重要功能，（Barrios-Gonza´lez et al.1993a）。 寻找这些引起所谓的固体培养生理性的“固体培养基因”已 成为当前研究的主题（Barrios-Gonza´lez et al. 2008; Ishida et al. 2000; Te Biesebeke et al. 2005）。
Wis 54-1255 转 化 P2-32
筛
选
Wis 54-1255 npe10
30μg/ml 腐草霉素
转化菌株
转化菌株
30μg/ml腐草霉素
30–80μg/ml的梯度培养基
对照
30–80μg/ml的梯度培养基
材料和方法
青霉素在琼脂上的产量
Somerson培养基制成的琼 脂块
（g/l,乳糖110，葡萄糖14， CaCO3 20，KH2PO4 6， MgSO4•7H2O 6，谷物浸提液 70，苯乙酸1.4）