实验二蔗糖酶
蔗糖酶活力实验报告
一、实验目的通过本实验，了解蔗糖酶的活力及其影响因素，探究温度、pH值、抑制剂和激活剂对蔗糖酶活力的影响，为后续研究蔗糖酶的应用提供基础。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种水解酶，能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验采用比色法测定蔗糖酶活力，通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成还原糖的速率，从而反映酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蔗糖酶：市售或实验室自备（2）蔗糖：分析纯（3）葡萄糖标准溶液：0.1 mol/L（4）3,5-二硝基水杨酸（DNS）：分析纯（5）盐酸、氢氧化钠：分析纯2. 实验仪器：（1）电子天平（2）恒温水浴锅（3）紫外可见分光光度计（4）移液器（5）试管四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线绘制：（1）配制不同浓度的葡萄糖标准溶液（2）将各浓度葡萄糖溶液分别加入试管中，加入适量DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线2. 蔗糖酶活力测定：（1）配制酶反应体系：取一定量的蔗糖溶液，加入适量蔗糖酶，置于恒温水浴锅中（2）每隔一定时间取样，加入DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）根据标准曲线计算还原糖浓度（5）根据酶反应体系中蔗糖浓度和反应时间，计算酶活力3. 影响蔗糖酶活力的因素：（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在不同温度下测定酶活力（2）pH值对蔗糖酶活力的影响：在不同pH值下测定酶活力（3）抑制剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的抑制剂，测定酶活力（4）激活剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的激活剂，测定酶活力五、实验结果与分析1. 葡萄糖标准曲线绘制根据实验结果，绘制葡萄糖标准曲线，相关系数R²为0.998，表明曲线拟合度良好。
2. 蔗糖酶活力测定在不同反应时间下，酶活力随时间延长而增加，说明蔗糖酶具有催化活性。
3. 影响蔗糖酶活力的因素（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在40℃时，酶活力最高，随着温度升高或降低，酶活力逐渐下降。
酶处理实验报告
一、实验目的1. 了解酶的特性和应用。
2. 掌握酶处理的基本原理和方法。
3. 通过实验验证酶处理的效果。
二、实验原理酶是一种具有催化功能的蛋白质，能够加速生物体内化学反应的进行。
酶处理是指利用酶的特性，将酶应用于生物体或生物制品中，以达到特定的目的。
酶处理具有高效、专一、温和等优点，广泛应用于食品、医药、环保等领域。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）原料：玉米淀粉、蔗糖、蛋白质等。
（2）酶制剂：淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶等。
（3）试剂：NaOH、HCl、NaCl等。
（4）指示剂：酚酞、甲基橙等。
2. 实验仪器：（1）天平、电子秤。
（2）烧杯、试管、滴定管。
（3）加热器、搅拌器。
（4）显微镜、酶标仪等。
四、实验方法与步骤1. 酶处理实验一：淀粉酶处理玉米淀粉（1）称取一定量的玉米淀粉，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入适量的淀粉酶，在适宜的温度和pH值下进行酶解反应。
（3）反应结束后，加入适量的碘液，观察颜色变化，判断淀粉是否被分解。
2. 酶处理实验二：蔗糖酶处理蔗糖（1）称取一定量的蔗糖，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入适量的蔗糖酶，在适宜的温度和pH值下进行酶解反应。
（3）反应结束后，加入适量的 Benedict 试剂，观察颜色变化，判断蔗糖是否被分解。
3. 酶处理实验三：蛋白酶处理蛋白质（1）称取一定量的蛋白质，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入适量的蛋白酶，在适宜的温度和pH值下进行酶解反应。
（3）反应结束后，加入适量的 Folin-Ciocalteu 试剂，观察颜色变化，判断蛋白质是否被分解。
五、实验结果与分析1. 酶处理实验一：淀粉酶处理玉米淀粉实验结果显示，淀粉酶能够有效分解玉米淀粉，碘液反应颜色由蓝色变为无色，说明淀粉被分解。
2. 酶处理实验二：蔗糖酶处理蔗糖实验结果显示，蔗糖酶能够有效分解蔗糖，Benedict 试剂反应颜色由蓝色变为红色，说明蔗糖被分解。
3. 酶处理实验三：蛋白酶处理蛋白质实验结果显示，蛋白酶能够有效分解蛋白质，Folin-Ciocalteu 试剂反应颜色由黄色变为绿色，说明蛋白质被分解。
综合性试验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测定
综合性实验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测（一）实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用3.5 —二硝基水杨酸法测定酶活力。
掌握各步骤的实验原理和方法。
（二）实验原理本实验采用Bradford法［10］又称考马斯亮蓝染色法（Coomassie brilliant blue staining）测定蛋白浓度，属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。
其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用作蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在OD465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，蛋白质-色素结合物最大吸收峰改变为OD595nm其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡，反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法高近4倍，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度，在10~100gg/mL蛋白质浓度范围内成正比。
因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
本实验采用DNS法［11］测定，属于染料结合法的一种。
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中蔗糖（双糖）和淀粉（多糖）是非还原糖。
蔗糖酶能催化非还原性蔗糖的1,2-糖昔键裂解，释放出等量的D-葡萄糖和D-果糖［12］。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5 —二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸（图1）。
“蔗糖酶的分离纯化及鉴定”实验目标及PBL问题
实验一、蔗糖酶的提取及粗分离
1. 蔗糖酶的用途，研究蔗糖酶的意义？蔗糖酶(Sucrase , EC 3.
2. 1. 26)叉称转化酶(Invertase)。
可作用于B-1 , 2糖苷键，将蔗糖水解为n葡萄糖和n果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1. 36〜1. 60 倍，在工业上具有较高的经济价值‘“。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，
制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
10分
2. 蔗糖酶有哪些性质？包括酶的适用pH和温度、等电点等。
蔗糖酶的最适温度为45 °C
~50 C，最适ph为4.0~4.5。
CuCl:对蔗糖酶有激活作用，而AgC］对蔗糖酶则其抑制作用，NaCI，KCI，FeSQ对蔗糖酶活性无明显作用，但相对活力都保持在70 %以上。
等电点5.6
10分
3. 蔗糖酶存在于什么材料中？你选择哪种材料来提取？为什
么？10分
4 .蔗糖酶属于胞内酶，提取前需要破壁，破壁方法有哪些？15分
5 .蔗糖酶提取溶剂如何选择？为什么？10分
7.蛋白质的粗分离方法有哪些？各有什么优缺点？如何选择？25
分
实验二、蔗糖酶的层析分离(一)
一、实验目标
根据初步纯化以后的样品性质选择一种柱层析方法进行纯化，目
标是纯化效果好，回收率高。
二、导学问题
1蛋白质层析分离方法有哪些？10分
1蛋白质层析分离方法有哪些？10分
2 .各测定方法的原理？20分。
酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓和酶活力测定
分实验一：蔗糖酶的提取与初步纯化
一、实验目的
➢ 学习蔗糖酶分离提取的原理
➢ 学习掌握细胞破壁、有机溶剂沉淀蛋白质的原理 与操作
二、实验原理 细胞破碎的方法
高压匀浆破碎法（homogenization）
பைடு நூலகம்
机械法
振荡珠击破碎法 (Skaking Bead) 高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding）
蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式 :
存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活 力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成 分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式
存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶
酵母细胞结构图
（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min
（5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。
（6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。
（7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。
（8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心 10分钟。
酶是生物体内具有催化活性的物质，可据酶蛋 白的结构和性质来选择分离提纯方法和含量测 定。
酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及 收率；依据其性质（分子大小、溶解度、电荷、 吸附等）进行分离; 同时用测定酶活力的方法了 解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。
本实验由四个分实验组成：
✓蔗糖酶的提取与初步纯化 ✓蔗糖酶各级分酶蛋白质浓度的测定 ✓蔗糖酶各级分酶活力的测定 ✓离子交换柱层析纯化蔗糖酶
超声波破碎法（ultrasonication） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock）
设计一个蔗糖酶专一性实验
设计一个蔗糖酶专一性实验
当设计一个蔗糖酶（也称为葡萄糖醛酸酶）的专一性实验时，可以遵循以下步骤：
1. 实验目的：确定蔗糖酶对于蔗糖的特异性反应，以此来评估其专一性。
2. 实验材料：
- 蔗糖酶溶液
- 蔗糖溶液
- 葡萄糖溶液
- 缓冲液（适量）
- 试管
- 称量器具
- 恒温水浴
- 吸光度计
3. 实验步骤：
a. 准备工作：
- 为蔗糖酶溶液和蔗糖溶液分别设置适当的浓度，根据实验需求调整。
- 准备缓冲液，以确保反应的pH值适合蔗糖酶的活性。
b. 实验操作：
- 取一组试管，每个试管中加入相同体积的蔗糖酶溶液和缓冲液。
- 将第一个试管中加入蔗糖溶液，作为正对照组。
- 将第二个试管中加入等体积的葡萄糖溶液，作为阴性对照组。
- 将其余的试管中添加其他碳水化合物（如淀粉酶、乳糖酶等）作为非特异性对照组。
- 将所有试管放置在恒温水浴中，使其保持在适宜的温度，维持一定的反应时间。
c. 反应结束后，使用吸光度计测量每个试管中的吸光度，并记录下来。
d. 分析结果：
- 与正对照组相比较，如果蔗糖酶溶液在蔗糖试管中显示出显著较高的吸光度，则表明蔗糖酶对蔗糖具有专一性。
- 与阴性对照组和非特异性对照组相比较，如果蔗糖酶溶液在这些试管中显示较低的或无显著差异的吸光度，则表明蔗糖酶对其他碳水化合物没有显著反应。
请注意，这只是一个示例实验设计，确保在实验过程中遵守实验室安全操作规范，并根据具体研究需求进行适当的修改和优化。
蔗糖酶生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
蔗糖酶综合性实验报告
一、实验目的1. 了解蔗糖酶的特性和功能；2. 掌握蔗糖酶提取和纯化的方法；3. 学习测定蔗糖酶活力和专一性的实验技术；4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种水解酶，可以将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验通过提取和纯化蔗糖酶，测定其活力和专一性，并分析影响其活性的因素。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母菌、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等；2. 实验试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌、碘液、斐林试剂等；3. 实验仪器：旋光仪、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 蔗糖酶提取（1）将酵母菌接种于含有葡萄糖的培养基中，37℃培养24小时；（2）收集培养液，离心分离菌体；（3）将菌体悬浮于磷酸缓冲溶液中，加入一定量的氯化钠和磷酸氢二钠，超声波破碎菌体；（4）离心分离酶液，得到粗提蔗糖酶。
2. 蔗糖酶纯化（1）将粗提蔗糖酶溶液通过硫酸铵分级沉淀法进行纯化；（2）收集沉淀，用磷酸缓冲溶液溶解，透析去除小分子物质；（3）通过凝胶过滤色谱法进一步纯化蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力测定（1）采用硫酸铜法测定蔗糖酶活力，以葡萄糖生成量为指标；（2）设置不同浓度的蔗糖溶液，在特定条件下测定酶活力；（3）绘制酶活力曲线，确定最适酶浓度和反应时间。
4. 蔗糖酶专一性实验（1）将蔗糖酶分别作用于蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等底物；（2）通过比色法测定反应产物的生成量；（3）分析酶对不同底物的催化效率，确定蔗糖酶的专一性。
5. 影响蔗糖酶活性的因素实验（1）考察pH、温度、离子强度等因素对蔗糖酶活性的影响；（2）设置不同pH、温度、离子强度等条件，测定酶活力；（3）分析影响蔗糖酶活性的因素。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶提取和纯化通过超声波破碎菌体和离心分离，成功提取出粗提蔗糖酶。
经过硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶过滤色谱法，纯化得到较高纯度的蔗糖酶。
蔗糖酶的提取和纯化步骤
色1小时。
10. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直 到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不
同纯化过程对杂蛋白去除状况。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
低分子量标准蛋白试剂盒:
•
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白
MW=97,400 MW=66,200
②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。
蛋白含量测定的计算
Pr (mg/ml)=
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
BSA标准液 250 µ g/ml
SDS-PAGE电泳实验过程
1. 准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干(实验室前后的空调
蔗糖酶米氏常数的测定操作方法
1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至20U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0--7编号，0为对照管。 3）按表 1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使 温度平衡，以下同）10min。
4）取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。
Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
6、样品预处理：
低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4,牛血清白蛋 白。 （1）低分子量蛋白Mark、牛血清白蛋白和E4的样品 由实验室提供。
（2）E1,E2,E3,E4分别取20µ l，再加入20µ l 2倍 (2X)样品缓冲液，在沸水中煮3分钟(本次实验1个 E3、E4-1和E4-2由实验室提供)，点动离心除沉淀。
线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在
蔗糖酶提取实验报告
1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。
2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。
3. 掌握酶活性测定的方法。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验采用酵母作为原料，通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶，并对其进行活力测定。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母（安琪酵母粉）2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）6. 3，5-二硝基水杨酸（DNS）仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备：- 称取1g酵母粉，加入10ml磷酸盐缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
2. 酶液的提取：- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜。
- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集上清液即为粗酶液。
3. 酶液的透析：- 将粗酶液置于透析袋中，置于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中透析过夜，以去除硫酸铵等小分子杂质。
4. 酶液的活力测定：- 取1ml蔗糖溶液（2%蔗糖溶液），加入1ml透析后的酶液，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 取0.5ml反应液，加入2ml DNS试剂，沸水浴5分钟。
- 取出后，加入4ml蒸馏水，在540nm波长下测定吸光度。
五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果：- 通过DNS试剂显色，根据吸光度计算出酶的活力。
2. 结果分析：- 通过对比不同处理条件下的酶活力，分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。
六、实验结论1. 通过本实验，成功从酵母中提取了蔗糖酶。
2. 酶的提取、纯化过程中，酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。
3. 透析法是一种有效的酶纯化方法，可以去除小分子杂质，提高酶的纯度。
实验2-离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶.
方法2、一步洗脱法： 上样后， 用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为
0.8ml～1ml/min，洗去DEAE－Sepharose Fast Flow未吸附的杂蛋白， 待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。用0.15mol/LNaCl 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液继续洗脱被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脱流 速为0.8ml～1ml/min，4ml/管/5min，直至待层析柱流出液在核酸蛋白检 测仪上绘出的基线稳定。测定各接收管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若 干管酶液集中，量出总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含 量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于“用正交法测定几种因 素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验），样品低温－20℃保存。
加样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为 0.8ml～1ml/min，洗去未被DEAE —Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂 蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液NaCl梯度洗脱（浓度为0-1mol/L NaCl ），层析柱 联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液 和50ml含1mol/L NaCl的0.05ml/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。洗脱流速为 0.8～1ml/min，每4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。跟踪测定各管的 蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样 品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定、SDS-PAGE分析、 酶的基本性质实验和用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半 自主性设计实验） ，样品低温－20℃保存。
蔗糖酶活力测定
一、目的了解植物组织中提取蔗糖酶的方法，掌握蔗糖酶活力测定的原理。
二、原理本实验以Nelson 方法测定酶活力，其原理是：蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖作为还原糖含有的自由醛基，在碱性溶液中将Cu 2+ 还原，还原糖本身被氧化成羟酸；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物（砷钼蓝），在510nm 波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的活力，该法测定的范围为25~200μg。
三、主要仪器及试剂四、操作步骤1．标准曲线制作（1）取9 个具塞试管，按表1 加样：（2）向每管中加1mL Nelson 试剂，盖上塞子，置沸水浴中20 min。
冷至室温，向每管中加1 mL 砷钼酸试剂。
（3）5 min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，混匀。
（4）在510 nm 下测定光密度，以还原糖葡萄糖为横坐标，以OD510nm 值为纵坐标，制作标准曲线。
2．酶活力测定取2g 小麦苗，加入2mL 乙酸缓冲液，在冰浴中用研钵研磨成糊状，12 000r/min 离心10min，留取上清液用于酶活测定。
取2 支具塞刻度试管，向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml，0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL，适当稀释的酶液1mL，以同样处理但不加酶液者为空白对照，室温下放置10min。
然后向每管中加1mL Nelson 试剂，置沸水浴中20min。
冷却至室温，向每管中加1mL 砷钼酸试剂，5min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，510 nm 下比色，测定光密度OD510nm。
五、实验结果活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定义为酶的1 个活力单位（U）酶活力的影响教师：XXX实验类型：基础学时：10(参考)内容：一、实验目的初步掌握用正交表设计实验方案并用数理统计方法处理实验数据的步骤和注意事项。
二、实验原理酶的催化作用受多种因素的影响。
欲求某因素对酶活力的影响，通常是固定其它因素，测定该因素不同水平下的酶活力。
蔗糖酶的提取及活力
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定摘要：本学期共做了六次生化实验。
.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。
实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。
实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。
将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。
也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。
第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。
此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。
第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。
利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。
并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。
第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。
同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。
测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。
第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。
目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。
本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。
其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。
最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。
此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。
最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。
关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD正文：1，蔗糖酶的提取及提纯1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
生物化学实验-蔗糖酶的提取
三、实验材料与试剂
1、实验材料 市售干酵母粉 10g/组(3～4人）
2、实验试剂
⑴ 石英砂，
⑵ 95% 乙醇(-20℃），
⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 1、电子天平（称量样品）； 2、研砵（每组一套）； 3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）； 4、托盘天平（离心管平衡用）； 5、高速冷冻离心机； 6、恒温水浴箱（50℃）； 7、制冰机； 8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 ； 9、7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架 ； 10、－20℃冰箱。
五、实验操作方法和步骤 分组操作：每组3～4人。
1、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细 粉末状（约15分钟），量取总体积50ml 的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移 到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分 钟，收集上清液（样品I）并量出体积V1,另留1ml上清液（标注样品I ）放 置－20℃冰箱保存，用于后续实验。
七、思考题 本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为Leabharlann 有哪些方法可以运用？说说你的设想。
下次实验
实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
实验一 蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎
细 机械法 胞 破 碎 的 常 用 方 法 非机械法
液体剪切法 超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法
固体剪切法
蔗糖酶包埋实验报告
一、实验目的1. 了解和掌握蔗糖酶包埋技术的基本原理和方法。
2. 通过包埋实验，提高蔗糖酶的稳定性和重复使用性。
3. 探讨不同包埋材料对蔗糖酶活性的影响。
二、实验原理蔗糖酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、环保等领域。
然而，游离的蔗糖酶在储存和运输过程中易失活，限制了其应用。
包埋技术是将酶包裹在特定的载体材料中，以提高酶的稳定性和重复使用性。
本实验采用海藻酸钠作为包埋材料，通过物理交联的方式将蔗糖酶包埋在其中。
三、实验材料1. 蔗糖酶：来源于酵母，酶活为2000 U/g。
2. 海藻酸钠：化学纯，分子量为10,000-15,000 Da。
3. NaCl：分析纯。
4. CaCl2：分析纯。
5. 蔗糖溶液：浓度为10%。
6. 离心管、移液器、恒温培养箱、显微镜、酶标仪等。
四、实验方法1. 酶液制备：将蔗糖酶溶解于0.1 M NaCl溶液中，调节酶活浓度为200 U/mL。
2. 海藻酸钠溶液制备：将海藻酸钠溶解于0.05 M CaCl2溶液中，搅拌均匀，待用。
3. 包埋过程：a. 将酶液与海藻酸钠溶液以一定比例混合，充分搅拌均匀。
b. 将混合液滴入装有0.1 M NaCl溶液的离心管中，静置一段时间，形成凝胶珠。
c. 将凝胶珠放入0.1 M NaCl溶液中，室温下保存。
4. 酶活测定：a. 将包埋后的蔗糖酶凝胶珠放入0.1 M NaCl溶液中，37℃下预处理一段时间。
b. 将预处理后的凝胶珠加入10%蔗糖溶液中，37℃下反应一段时间。
c. 取出凝胶珠，用蒸馏水洗涤，测定反应液中葡萄糖浓度。
d. 根据葡萄糖浓度计算蔗糖酶的酶活。
五、实验结果与分析1. 不同海藻酸钠浓度对酶活的影响：随着海藻酸钠浓度的增加，酶活逐渐降低。
这是因为海藻酸钠浓度过高，导致酶的扩散受限，进而影响酶的活性。
2. 不同包埋时间对酶活的影响：随着包埋时间的延长，酶活逐渐降低。
这是因为包埋时间过长，导致酶的结构发生变化，进而影响酶的活性。
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提取工艺
1. 破碎酵母细胞的方法：
蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎 细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持 低温防止酶失活；
或者采用自溶法（适当的酸度和温度下利用酵 母菌自身的酶系破坏细胞壁），此方法较为温 和，但是时间较长，需加入少量防腐剂，防止 过程中外界细菌污染；
原则：低温，处理时间短，防止酶失活。
2. 选择性热变性： 根据蔗糖酶的耐热性质，将热不稳定性杂蛋白变性除去， 而蔗糖酶保持活性仍在上清液中；该法简便易行。
离心获得粗酶液 吸取3mL酵母细胞破碎液于离心管中（两组同学配平），5000rpm 15min， 保留上清液；——粗酶液
分离纯化获得纯酶液 1. 吸取剩余的7mL酵母细胞破碎液于烧杯中，45度水浴15min，缓慢搅拌（防
止产生泡沫，蛋白质变性），迅速冷却， 5000rpm 15min，保留上清 液；——选择性热变性除去杂蛋白 2. 将上清液置于烧杯中，加入等体积预冷的无水乙醇（乙醇终浓度约50％）， 边加边缓慢搅拌，－20度静置15～20min，5000rpm 15min，保留沉淀 物；——有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶 3. 吸取7mLPBS（pH7.2）于沉淀物中，轻轻搅拌促溶；——纯酶液
原则：1、选择合适的温度和加热时间，防止目的物变性， 2、溶液的蛋白质浓度要合适，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。
3. 有机溶剂沉淀法： 根据蔗糖酶的分子量和亲水性，在溶液中加入一定量的无水乙醇溶 液，利用其脱水作用，破坏了蛋白质分子表面的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下来，而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的 物沉淀的条件。
原则：1、注意在低温下操作，故无水乙醇要预冷； 2、边加乙醇边搅拌溶液，防止局部乙醇过浓，导致酶变性失活； 3、离心后应迅速将上清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，避免酶与有 机溶剂长时间接触，防止其变性。
测定酶活的原理
1. 蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖水解为D－葡萄糖和D－果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂，Mn2+ 是其抑制剂。
光度计。
实验原理
蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法； 蛋白质等生物活性大分子的提取方法。
提取工艺和酶活测定
蔗糖酶
1. 蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下可保持酶活不变；在 pH3.0~8.0范围内均可保持较高的酶活；
2. 蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化， 或者加入还原剂（如Vc）保持酶活力；
3. 提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、 强碱等变性的因素；
4. 一般先选择分辨率低处理量大的方法（如萃取、 沉淀、吸附）浓缩酶，再采用分辨率高的方法 （如离子交换层析、亲和层析、超滤）精制；
5. 通过酶活测定，调节提取条件。
实验步骤
反复冻融法破碎酵母细胞 称取0.5g活性干酵母粉，0.2g石英砂，置于预冷的研钵中，研磨至粉状， 加入10mLPBS（pH7.2），混合均匀，研磨5min ,－20度冷冻（液面结一层 薄冰即 可），再研磨5min；
2. 葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5－二硝基水杨酸共热 后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成 正比例关系。
3. 蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。
提取酶注意事项
1. 了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性， 选择合适的提取条件；
2. 提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加 一些保护剂（如还原剂、金属螯合剂等）；
思考题
简述影响蔗糖酶得率的因素。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
酶活测定
1. 蔗糖酶将底物水解为还原糖
试剂
粗酶液组
（均40度预 测定组1 热）
对照组1
酶液（mL）
1.0
1.0
纯酶液组 测定组2 对照组2
1.0
1.0
1N NaOH
－
0.5
－
0.5
液（mL）
5%蔗糖液
2.0
2.0
2.0
2.0
（mL）
40度水浴10min，自来水冷却
1N NaOH
0.5
－
0.5
－
液（mL）
2、DNS法测定还原糖量
试剂
粗酶液组
测定组1 对照组1
水解液
1.0
1.0
（mL）
纯酶液组
测定组2 对照组2
1.0
1.0
蒸馏水
1.0
1.0
1.0
1.0
（mL）
DNS液
1.0
1.0
1.0
1.0
（mL）
沸水浴5min，自来水冷却，稀释至12mL，以对照组 调零，记录测定组OD540nm。
实验结果
计算酶活力
将吸光值代入葡萄糖标准曲线，得到1.0mL水解 液中还原糖量（m） 酶活力（U/mL）＝m（mg）×3.5（水解液总体 积）/1.0（吸取酶液体积） 蔗糖酶活力定义：在一定实验条件下，在规定时 间内释放1mg还原糖的酶量为一活力单位。 葡萄糖量标准曲线的回归方程为： y=0.6746x+0.02736 y：吸光值 x：还原糖量
生物技术综合实验
2019.3
实验二、酵母蔗糖酶的提取和 酶活测定
实验目的
学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法； 学习提取生物活性大分子的方法。
实验材料
材料：活性干酵母粉、石英砂； 试剂：95％冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、
5％蔗糖溶液、1N NaOH溶液； 仪器：水浴锅、高速冷冻离心机、722型分光