第七章诱变育种

第二节 诱变育种前的准备工作
由于诱变育种工作量大,周期长,因此,在诱变育种前必需 做好充分准备,如了解菌种的培养特征,了解培养基组分和培 养条件对目标产物合成的影响等,并进行严格设计,以提高诱变 育种的效率.
一、了解影响菌种生长发育的主要因素
1.培养基: ①培养基的营养成分决定微生物的营养生长和生殖生长:培养 基是影响菌种生长和孢子形成的重要因素之一,对产生孢子的 微生物来说,培养基的营养成分是控制菌体生长和孢子形成的 主要因素,营养太丰富,会促进菌丝大量生长而不利于孢子形 成.
4.温度:温度对菌种的影响很大，在培养过程中温度越高，生 长越快，但超过一定的范围，会使生产能力下降，甚至引起 变异，高温对菌种生产能力的影响很大。 5.湿度：湿度也影响菌种生长和孢子形成。相对湿度高，生 长慢，相对湿度低，生长快。放线菌在不同相对湿度下培养 时，其形成的孢子数量有明显的影响。一般放线菌要求相对湿 度约40－60％，而真菌要求相对湿度约70％。 6.药品和原料的质量：药品规格和原料来源不同会影响菌种 的质量。为了使菌种质量保持稳定，药品和原材料的质量应相 对稳定，如有变动，要适当调整培养基的配比。 二、了解菌株的菌落形态 每个菌株在特定的培养基和培养条件下具有特定的菌落形态和 培养特征。霉菌和放线菌的菌落形态特征通常包括菌落大小、 形状、高度、放射线多少、外观组织结构（如粉状、绒毛状或 絮状等）、孢子多少和色泽、可溶性色素等。细菌的菌落形态 特征包括菌落大小、形状、高度、颜色、色泽、边缘结构、表
第一节

诱变育种的作用和特点


微生物诱变育种是用人工诱变方法诱发微生物基因 突变，通过随机筛选，从多种多样的突变体中筛选 出产量高、性能优良的突变体，并找出突变体的最 佳培养基和培养条件，使突变体在最适环境条件下 大量合成目的产物。因此，诱变、筛选和改变环境 因素是诱变育种的三个重要环节，三者相辅相成， 缺一不可。 生产选种的局限性：以微生物的自然变异作为基础 的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变 频率仅10-6-10-10左右。 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止 国内外提高菌种产量、性能的主要手段。
②不同微生物对斜面培养基的要求不同:放线菌喜微碱性,孢子 培养基的碳源/氮源比要低些.霉菌喜偏酸,孢子培养基的碳源 要高些,氮源要低些.细菌喜偏碱,一般要求培养基的氮源丰富 而碳源低些. 2.斜面培养基制备技术:①除了培养基的营养成分外,培养基的 配制技术也是非常重要的.②配制培养基时,要注意原料质量、 规格,并要相对稳定;③培养基的灭菌时间、压力要适宜。④培 养基加入的琼脂数量因条件不同而灵活掌握；⑤培养基装量 也会影响孢子的形成。装量越多孢子不易形成。⑥培养基表 面的冷凝水不宜过多。 3.移种的密度：移种的密度要适宜，特别是丝状真菌，因为 接种量过密，不同菌落间的菌丝会交织在一起，容易吻合产 生异核体。适宜的接种量是使一个斜面上的菌落基本上能单 独生长。
诱变
物理、化学或生物诱变方法
一、诱变育种的作用
诱变育种的作用主要有以下几个方面： 1.提高有效产物的产量：通过诱变育种可以提高代谢 产物的产量。新分离菌株必需多次诱变育种才能获得 高产，生产菌种也需经过诱变育种提高产量，降低 成本。 2.改善菌种特性，提高产品质量： 通过诱变育种可以改进产品质量，提高有效组 分含量，还可以改善菌种特性，选育出更适合于发 酵工业的突变株。 3.开发新产品：通过诱变育种，可以获得各种突变株， 其中有些能改变产业结构，有些能去除多余的代谢 产物，有些能改变原有代谢途径，合成新的代谢产 物。
新生孢子产生约需3-4d,第二代7d,第三代约10d,将1,2,3 代新生孢子分别进行传代、保存、埋沙土,并测定生产能力,结 果新一代能保持90% 的原高产特性,二代只能保持50％，原 高产特性，第三代仅保持10％的原高产特性。由此可见，用 第一代孢子制备斜面生产能力最高，所以，单菌落或斜面的 培 养时间缩短为3－4d，用这样的孢子进行诱变育种就容易筛 选到高产菌种。 2.研究菌种生物学特性与产物合成的相关性，即对提高菌种 产量有益的特性，如菌落大小、类型、产色素，斜面生长 特点，种子生长情况，发酵情况等都可能与产量有关。如 研究头孢菌素C产生菌－－顶头孢霉菌时发现抗生素产量随 着节孢子体积增大或数量增加而提高。在合成培养基中加 入甲硫氨酸后可增加节孢子的数量和抗生素的产量。同时 还发现，基质菌丝颜色的变化和菌落直径与产量也有一定 的关系，凡菌落有大变小伴随颜色由深变浅时，产量会逐 步提高。
第三节 诱 变
诱变育种主要包括诱变和筛选两大步骤，其中诱变过程包 括：出发菌株的选择、单孢子或单细胞悬浮液的制备、诱变剂 及诱变剂量的选择、诱变的处理方法等。
一、出发菌株的选择和纯化
出发菌株是指用于诱变的试验菌株。出发菌株的选择是决定 诱变效果的重要环节。长期育种的经验证明，诱变处理前选择 怎样的出发菌株，以及对出发菌株的生物学特征的全面了解是 很重要的。特别对菌种的遗传背景、稳定性、纯一性以及形 态、生理、生化等特性的研究，都有利于提高诱变效果。 1.选择具备一定生产能力或某种特性的菌株。菌株首先要具 有我们所需要的特性，另外还应具备一定的生产能力，同时还 应具有某种优良特性（如产孢子多，不产或少产色素，生长
第七章 诱变育种
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花菇
第一节 诱变育种的作用和特点 第二节 诱变育种前的准备工作 第三节 诱 变 第四节 筛选 第五节 常见突变株的筛选
带图象分析系统的微生物菌种 显微观察装置
工业菌种的育种方针

工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定 生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通 过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不 良性质或增加新的性状。


工业菌种改良方法
(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加 特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来 提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代 谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。 (2)增加前体物的浓度。 (3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提 高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产 品的耐受力。 (4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的 结构类似物抗性。
4.高产菌株的诱变育种特点：
①筛选工作量大：由于产量性状受多基因控制，其诱变过程十 分复杂，诱变后产生高产突变株的频率很低，因此需要从大 量群体中去筛选高产菌株。
②筛选工作有一定的盲目性：由于数量性状的变异是连续的， 选育高产菌株往往缺乏明确的正负效应，造成筛选工作具有一 定的盲目性。 ③诱变育种工作难度较大：产量突变是许多细微突变的多次积 累，高产菌株选育中多采用多步叠加累积诱变选育法。一般 很难一次性得到产量大幅度提高的菌株；单个诱变阶段产量 提高幅度不高，一般仅5－15％，这一幅度与亲本群体的生 产能力波动范围差不多，加上操作误差也很大，有时甚至超 过5－15％，所有这些都增加了诱变育种工作的难度。
工业菌种育种的方法

诱变 基因转移 基因重组
育种过程


包括下列3个步骤： (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的 引入。 (2)希望基因型的选出。 (3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规 模)。
选择育种方法时综合考虑的因素
(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批 式或连续发酵试验)； (2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识 的明了程度； (3)经济费用。 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚 少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术： 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的 认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。
2)非遗传因素:由非遗传因素引起的不同类型的菌落是一种假 变异,不能遗传,即当菌种回到原来的培养基和培养条件下,其 形态又可以恢复原状. (1)培养基组成不同; (2)配制培养基的药品、原材料来源、规格、质量的差别. (3)培养基平板厚薄不一引起营养、水分分配不均. (4)平板上菌落密度的稀密引起营养供应的差异. (5)菌落不同生长阶段,其形态特征不一. 实验中应尽量避免由非遗传因素引起的菌落形态变化(培 养基和培养条件应尽量保持一致,少变化),区分和识别不同菌 落类型的特征,及其与生产能力之间的关系,对诱变育种具有非 常重要的意义. 三、了解菌种特性及其与生产性能的关系 1.要多方面考察菌种的生活史,了解它们的形态、生理、生 化等特性,以及这些特性与代谢产物合成的关系. 如土霉素培养12d的单菌落包含了三代的生活周期,第一代
提高特定基因的表达水平


(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达 载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动 子；修改现有表达信号，提高基因效力等。 (2)诱导解除基因表达抑制的突变。
改进菌种的生长效率
提高菌株对底物的利用率方法： (1) 通过确定并改变代谢中的耗能部分; (2) 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。 (3) 赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底 物的利用能力，由此可降低操作费用。
结构、可溶性色素等。 1.区分不同菌落类型：一般情况下，菌种在同一种培养基和 培养条件下，往往会出现多种形态类型的菌落。不同类型的 菌 落，其生产能力有较大的差别；在特定的培养基和培养条件 下，每个菌种都有其占优势的菌落类型，这种主要类型的菌 落 形态、特征、生理生化特性及其生产能力基本上决定了菌种 的 特性，这种菌落类型称为正常菌落。 2.出现不同菌落类型的原因： 1）主要由遗传因素造成。 （1）自发突变：自发突变是一种常见现象。 （2）回复突变：高产菌株在传代过程中会产生回复突变。 （3）二倍重组体的分离：通过杂交或原生质体融合获得的二
二、高产菌株诱变育种的特点
诱变育种的主要目标是选育某种代谢产物合成能力强的高 产突变株，代谢产物生产能力强弱是一种数量性状。 1.遗传变异的质量性状：大多数典型的遗传性状是不连续的， 即不同的基因型产生相当不同的表型，相互之间没有重叠。如 孢子的颜色，形状；荚膜有无等形态特征，营养缺陷型等生理 特征。 2.遗传变异的数量性状：①是一个连续分布内的变化，例如抗 生素、氨基酸、有机酸、核苷酸等微生物代谢产物的生产能力 从高到低的差异是连续性差异。②数量性状是由多个基因的积 累作用所控制，每个基因所起的作用是有限的，③环境条件在 决定表型上起着很大的作用。 因此，数量性状也被称为多因子、多基因或多基因座性状。 3.特殊性状：除了质量性状和数量性状外的另一类性状，它的 表型差异是不连续的，但它的控制却是数量的（连续的）。遗 传因子和环境因子结合使得某些个体从一个表型状态达到另一 个表型状态的界限。糖尿病和癌症就是这样的例子，基因型带
3.研究菌种的最佳培养基和培养条件。由于微生物次 级代谢产物常常是多组分的，在多组分代谢产物的发 酵过程中，发酵培养基成分不同、发酵周期中的不同 阶段，各组分的比例也不同。因此，在研究菌种的最 佳培养基和培养条件时，需要研究培养基成分与各组 分之间的关系，以及研究发酵过程中各组分之间的变 化规律。 四、建立一个准确、简便、快速检测产物的方法 诱变育种工作量大，需从大量的分离菌株中去 筛选才能获得高产突变株，因此，必须建立适合于大 规模筛选的简便、快速的检测方法。 五、研究合适的菌种保藏方法 高产菌株或优良菌株来之不易，容易回复突变， 使优良性状消失，因此要事先研究最佳的菌种保藏方 法，以免高产菌株得而复失。
来潜在的危险，但基因型和环境的共同作用促使某些个体越过 由健康到患病的界限。 数量性状及其特点：由他们的平均数（mean）和方差 （variance）来描述。平均数通常记作x： X＝∑(Xi）／n 分布的n范围称为方差，记作s2或V。方差的平方根s称为标准 差（standard deviation）。 S2＝V＝ ∑（Xi－x）／（n－1） 通常生物体系的变化程度大致处于正态分布中，这是一种理 想的数学分布，它给出经典的钟形曲线，平均值s的区间内包括 68.3％的个体测量值，平均值1.96s的区间内包括95％的个体 测量值。