流式细胞学技术抗体的各种荧光标记颜色及波长及所占用通道
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析-精选文档
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
3.显色强度弱
一抗浓度过低或孵育时间过短，建议增加 一抗浓度或延长孵育时间。
4.无染色
组织中无目的抗原的表达。 一抗种属来源与二抗不匹配，建议实验前 确认一抗的种属来源。 显色物质与HRP系统不匹配，建议实验前 确认显色体系。
一抗孵育
荧光二抗孵育 流式细胞仪分析
流式细胞术常见结果分析
直方图：单参数分析
人外周全血细胞双参数散点图
散点图：多参数分析
UL 0.70 UR 24.2
LL 52.80
LR 22.3
常用细胞表型及意义：
（Cluster of Differentiation, CD）
CD3 总T细胞 CD4 T辅助/诱导细胞亚群 CD8 T抑制/细胞毒细胞亚群 CD19 B细胞抗原
3. BCIP/NBT显色法
产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组 分溶液，用于免疫组化、原位杂交、
western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色
4. BCIP/INT显色法
2. 组织芯片应用领域
组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的 基础研究、临床研究、应用研究和新药开发 等。 免疫组化染色（IHC）； 原位杂交（ISH）； 荧光原位杂交（FISH）； 原位末端标记分析（TUNEL）； 原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅 助的cDNA杂交。
3. Abgent 现有组织切片/芯片产品
免疫荧光常见问题分析
流式常用荧光染料概要
如何选择流式细胞仪测定常用的荧光染料
流式细胞仪测定常用的荧光染料有很多种,我们如何来选择流式细胞仪测定的常用荧光染料呢？
首先要考虑，他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也不同,选择荧光染料时，必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长做为重点考虑。
发射光波长，如：氩离子气体激光管,它的发射光波488nm；
氦氖离子气体激光管发射光波长633nm；
488nm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）；
PE（藻红蛋白）
PI（碘化丙啶）
CY5（化青素）
preCP(叶绿素蛋白)
ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。
激发光和发射光波长，如下：
流式细胞仪中常用的荧光染料光学特征以及需要的激光器
流式•细胞仪交流论坛：/forum-181-1.ht ml
荧光染料谱。
BrilliantViolet多色流式介绍
496
515/30
Brilliant Violet BUV661
Bright
348
355
661
670/25
Brilliant VioletBUV737
Bright
348
355
737
740/35
Brilliant Violet BUV805
Dim
348
355
805
820/60
三、BD HorizonTM Brilliant Blue 515 （BB515）
5）BV 染料和 BD FACS Buffer 很好的兼容性保证能用于各种流式实验，无毒，适合做流式分选及活细胞成像
二、BUV家族BD Horizon Brilliant UltraViolet (BUV Family)
1、家族成员BUV395 BUV496 BUV737 BUV805荧光素图谱
2、各BUV荧光素信息详细介绍
3、BV421明星product介绍
BD Horizon BV421 的亮度相当于 PE 或 比 PE 还要亮，比 Pacific Blue 亮 10 倍
更亮，更好的分辨率，弱表达抗原的第一选择，让 Pacific Blue 通道变得wonderful
BV421染色案例数据
4、Brilliant Violettm 染料标记流式抗体优势
710/50
Qdot705, eFluor700NC
Brilliant Violettm786
Bright
407
405
786
780/60
Qdot800
Brilliant Violet tm450
Dim
404
带您认识流式细胞术中的各种图
带您认识流式细胞术中的各种图流式图有很多种，最常用的是流式直方图和流式散点图，还有流式等高线图。
流式直方图只能显示一个通道的信息，流式散点图和流式等高线图可以同时显示2个通道的信息。
流式通道流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道：散射光通道有两个，包括FSC通道和SSC通道，一般所有的流式细胞仪均有这2个散射光通道；不同型号的流式细胞仪其荧光通道的多少差异较大，有的甚至没有光通道。
FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的大小。
细胞体积越大，其FSC值就越大。
所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。
SSC，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度（granularity）。
细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC 值就越大。
所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
一般在硏究细胞样品时，首先关注的就是样品中细胞的FSC-SSC 散点图，x轴代表FSC值，y轴代表SSC值，将细胞都显示于该散点图中，可以初步根据细胞的大小和颗粒度对细胞进行分群和分类。
样品细胞不需要标记任何荧光素偶联抗体，直接上样分析就可以得到样品细胞的FSC值和SSC值，其值代表的是细胞的大小和颗粒度这两个基本的物理特征，所以样品的FSC-SSC散点图又称为样品细胞的“物理图”。
荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。
如需要检测样品中是否有细胞表达某一CD分子，则需要标记荧光素偶联的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗体，其中的荧光素被相应的激光激发后产生荧光，该荧光信号通过光路系统被相应的荧光通道接收，就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子，以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信息。
荧光通道接收到的信号越强，表示细胞上结合的荧光素越多，那么细胞表面表达的该CD分子就越多，因此可根据荧光信号的强弱判断细胞表达该CD 分子的相对数量。
流式细胞仪测定常用的荧光染料
流式细胞仪测定常用的荧光染料
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。
488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE （藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。
他们的激发光和发射光波长分别是：
激发光波长（ηm）发射光峰值（ηm）
FITC 488 525（绿）
PE 488 575（橙红）
PI 488 630（橙红）
ECD 488 610（红）
CY5 488 675（深红）
PreCP 488 675（深红。
流式细胞术详解
流式细胞术详解一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA 含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D 公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
流式细胞仪试剂介绍
如何读懂荧光标记的单克隆抗体
Mouse anti-Human CD3-FITC Clone:UCHT1 Isotype:IgG1 Mouse Mouse: 抗体来源----小鼠 Anti-Human: 检测对象为人类细胞 CD3-FITC: 检测CD3的抗原, 该抗体为FITC荧光素标记 UCHT1: 抗体的Clone 株 IgG1 Mouse: 为抗体的免疫球蛋白亚型,所以选用的阴
CD3 ECD CD3 PC5
CD3 PC7
Performance
Vendor ‘X’
Vendor ‘Y’
Clear Resolution of Cellular Sub-sets
Performance Matters: Impact Of Photo-degradation
Control, t0
Finished Tandem Dye Three Lot Comparison of PC7
250
Performance
Fluorescence Intensity
200
150
Lot # 3021-101 Lot # 1828-47 Lot # 1828-95
100
50
0 550 600
Emission Wavelength (nm)
性对照应为Mouse IgG1-FITC
如何看懂试剂的说明
临床试剂
RD1=PE
标 记 的 荧 光 素
试 剂 包 装 规 格 大 小
如何看懂试剂的说明
科研试剂
科研试剂，以mg/g表示试剂包装大小，需 要做滴度实验，摸索最佳实验所需试剂量
如何看懂试剂的说明－试剂的货号识别
6开头的试剂为美国库尔 特生产
流式抗体标记步骤
1)细胞膜荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②按照上样管标记分别加入对应的荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应15min。
③加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。
④加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次。
⑤加入1mlPBS或者生理盐水重悬细胞，准备上样。
注意事项：●加入血样和抗体前，须注意编号和血样及抗体的一致性。
●实验室要注意冬天保温，夏天降温，防止室温过低或过高，影响抗原抗体反应。
●溶血时，溶血剂和血样的比例为50:1，当血样体积发生变化时，注意溶血剂体积的变化。
2)细胞膜kappa/lambda荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。
③加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤三次④沉淀物中按上样管标记分别CD45-PE-CY5和kappa/lambda试剂盒和同型对照，避光反应15~30min⑤加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次⑥保留沉淀物种加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。
注意事项：●沉淀物中的液体不能留太多，控制保留液体体积，保证抗体效价●溶血判断请参照细胞膜荧光抗体标记标准操作规程3)细胞内荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②按照上样管标记分别加入对应的包膜荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应10min。
③加入破膜剂试剂盒A液100ul剧烈震荡混匀，避光固定10min④加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑤沉淀物首先剧烈震荡混匀，然后小心加入破膜剂试剂盒B液100ul，不得震荡和剧烈摇晃，避光反应5min⑥加入上样管所标记对应的胞内荧光抗体，避光反应15min⑦加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑧重复步骤7两次，加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。
流式细胞学技术抗体的各种荧光标记颜色及波长及所占用通道
546
647 FL-3 FL-3 FL-3 PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5
PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5
FL-3 FL-3
FL-3 FL-3
FL-4 FL-4
PE/Cy5 PE/Cy5
FL-4 FL-4
PM-2 PM-1
PE-Cy5 PE-TR
FL-3 FL-2
Channel 5 Channel 5
645 649 650 650 696 650 650
660 FL-4 666 668 690 719 774 774 FL-4 FL-4 FL-3 APC APC APC APC/Cy5.5 APC/Cy5.5 APC/Cy7 APC/Cy7 APC/Cy7 APC/Cy7 APC/Cy5.5 APC APC APC APC APC/Cy5.5 APC/Cy5.5 APC/Cy7 APC/Cy7 APC APC APC APC/Cy5.5 APC/Cy5.5 APC/Cy7 APC/Cy7 FL-4 FL-4 FL-4 FL-4 FL-4 FL-5 FL-5 FL-7 FL-7 FL-7 FL-7 FL-7 FL-8 FL-8 APC APC APC APC/Cy5.5 PE/Cy5 APC/Cy7 APC/Cy7 FL-8 FL-8 FL-8 FL-4 FL-4 FL-9 FL-9 APC APC APC APC-Cy5.5 APC-Cy5.5 APC-Cy7 APC-Cy7 FL-4 FL-4 FL-4 FL-3 Channel 6 Channel 6 Channel 6 Channel 6 Channel 6
® ® ®
377 401 410 458 400 400 495 493
流式细胞技术原理和方法
流式DNA定量分析的染色原理
• 经DNA特异性染料染色的细胞群体， 通过测量区受激光照射后发出特异性 荧光，在一定条件下，荧光强度与细 胞内的DNA含量成正比。
流式细胞技术(Flow Cytometry)
流式细胞仪
流式细胞仪(Flow Cytometer, FCM)，又名荧
光激活细胞分类器 (Fluorescence Activited Cell Sortor, FACS), 它是将流体喷射技术、激光技 术、空气计数、r--射线能谱术及电子计算机等 技术与显微荧光光度计密切结合的仪器，开创
藻胆蛋白藻胆蛋白phycobiliproteinphycobiliprotein是近年发现的用于是近年发现的用于免疫荧光分析和标记各类配体的一种新荧光染免疫荧光分析和标记各类配体的一种新荧光染待测细胞被制成单细胞悬液经特异性荧光待测细胞被制成单细胞悬液经特异性荧光染料染色后加入样品管中在气体压力推动染料染色后加入样品管中在气体压力推动下进入流动室流动室内充满鞘液在鞘液下进入流动室流动室内充满鞘液在鞘液的约束下细胞排成单列流出流动室喷嘴口的约束下细胞排成单列流出流动室喷嘴口并被鞘液包绕形成细胞液柱与水平方向的并被鞘液包绕形成细胞液柱与水平方向的激光光束垂直相交发出荧光同时产生散激光光束垂直相交发出荧光同时产生散射光被荧光光电倍增管接收被积分放大射光被荧光光电倍增管接收被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器通反转换为电子信号输入电子信息接收器通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来过计算机快速而精确地将所测数据计算出来结合多参数分析从而实现了细胞的定量分结合多参数分析从而实现了细胞的定量分http
常用的免疫荧光染料
• 异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 是检测细胞总蛋白最常用的荧光染料。 • 藻胆蛋白(phycobiliprotein) 是近年发现的用于
流式配色及分析
如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。
精选2021版课件
47
胞内因子的含量与检测效果
如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。
开源：刺激活化T细胞。方法有二：
1:PMA（PHA/LPS...)＋Ionomycin: PMA能自由透过细胞膜，因此能绕过细胞膜受体直接激活PKC; Ionomycin则能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高； 只有PMA+Ionomycin联合应用才是使T细胞进入细胞周期的最有效的方法.
流式配色分析及实验设计
精选2021版课件
1
关于流式抗体
什么是荧光素
fitc pe
✓ 荧光素是具有荧光特性的染料 ✓ 只在特定波长激光照射后才发出自身荧光 ✓ 发出的精选荧20光21版颜课件色（波长）也是固定的 2
流式细胞技术：
在细胞分子水平上； 通过单克隆抗体； 对单个细胞或其他生物粒子； 进行多参数； 快速的； 定量分析。
红3
Pe-cy7
远红 4
Apc(AF647,ef660) 红 5
Apc-cy7(ApcH7,ef780)
远红 6
可以也仅可以最多选择8个荧光抗体去标 记抗原；
需要注意： 同一通道不可以选2种荧光抗体，例如： AF488，BB515,FITC 不可以同时使用；
精选2021版课件
19
染料的亮度与抗原表达强度相匹配
Tertiary: 低水平表达，激活性marker，或者表达区 分不明显
Example: CD25
CD4 CD45RA
CD25
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4
第四节 凋亡检测
1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染 色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡 细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释 放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的 固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少， 成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡 细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影 响结果的准确性。 可参看文章： /content/cell/20040914791.htm /content/cell/20040914792.htm
2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干 细胞移植及基因治疗方面的检测。 3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞 性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现 活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如 果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的 原因为血小板破坏过多所致。
4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） 的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发 生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成 障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的 GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的 主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞 或WBC上出现CD55或/和CD59的减少， 可诊断为PNH。
【免疫学实验】流式CBA多因子检测详解
【免疫学实验】流式CBA多因子检测详解CBA原理详细介绍Cytometric Bead Array（CBA），即细胞因子微球检测技术。
是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。
BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性，将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。
CBA的基本原理近似于ELISA的检测，即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。
详细原理介绍每个CBA微球大小一致，具有特定的荧光强度，包被有适用于特定分析（如其它抗体或者可溶性蛋白）的特异性捕获抗体（Capture Antibody），提供了类似ELISA孔板的捕获表面。
当微球和待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品（血清、血浆或者细胞培养液）中相应的抗原或蛋白结合，然后加入荧光标记的检测抗体，就会形成“三明治”夹心复合物。
最后通过流式细胞仪对特异性目的蛋白进行检测。
CBA的每种微球携带有不同强度的红色荧光，在流式细胞仪的FL3通道通过检测微球荧光强度的差异对目的蛋白定性；检测抗体带有PE荧光素标记，在流式细胞仪的FL2通道检测，通过检测抗体的PE荧光强度定量目的蛋白。
CBA技术特点CBA具有FCM的宽范围荧光检测特点，对样本需求量更少，检测更快速、更准确。
下面我们介绍一下CBA主要的技术特点:1、轻松实现多重检测。
最多可同时对一个样本中的75个目的蛋白进行精确定量。
2、样本需要量小。
仅需要50μL溶液就可进行一次检测。
3、更高的灵敏度。
分析灵敏度高达2.8pg/mL。
4、更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性。
CBA技术使蛋白定量的分析灵敏度高达pg/ml级别,检测范围达0-5000pg/ml，所有分析只需一组标准曲线。
根据抗体的荧光强度对目的蛋白定量，排除了ELISA反应中酶联放大产生的假阳性。
流式细胞术中应用的荧光染料介绍
流式细胞术中应⽤的荧光染料介绍当我们在进⾏多⾊流式分析的时候，对分析成功的⼀个关键影响因素是每个抗体选择何种荧光染料标记。
通常会有很多可⾏的结合，我们在做选择的时候有很多的因素需要我们去考虑。
对任何单克隆抗体，其阴性和阳性的信噪⽐相差四到六倍都取决于荧光素的使⽤。
相对的荧光强度也取决于使⽤的仪器。
⾼密度表达的抗原我们可以应⽤任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应⽤⾼信噪⽐⾼的荧光素，譬如PE或者APC标记的抗体来充分检测分离出阳性表达的细胞与阴性表达的细胞。
⾃发荧光个别的细胞有着他们各⾃特异性⽔平的⾃发荧光（荧光信号产⽣于他们⾃⾝）。
当在全波长荧光通道中进⾏观察的时候，⾃发荧光信号在长波长（>600nm）明显的降低。
对于有较⾼⽔平⾃发荧光类型的细胞，如长期组织培养的细胞，应使⽤较⾼发射波长的荧光染料（APC、APC-Cy7等）标记抗体，通常他们会有⼀个较好信噪⽐的结果。
对于那些不是有较多⾃发荧光类型的细胞，如新鲜的细胞，可以使⽤FITC 标记的抗体了。
以下为各种常⽤荧光素介绍：Alexa Fluor 488 has a spectrum almost identical to that of fluorescein isothiocyanate (FITC), but with extraordinary photostability. Because of this photostability, it has become a choice for fluorescent microscopy applications and has become popular in cytometry applications. It is detected in the FL1 detector of the FACSCalibur or FACScan. Unlike other fluorochromes with similar emission spectra, Alexa Fluor 488 is pH insensitive over a broad range.Alexa Fluor 633 is a practical alternative to APC as well as Cy5. Alexa Fluor 633 conjugates can be used in multi-color flow cytometry with instruments equipped with a second red laser or red diode. It is detected in the FL4 detector of the FACSCalibur. The FACScan cannot be used to detect Alexa Fluor 633 conjugates because the FACScan lacks a red laser or diode. Like other Alexa Fluor dyes, Alexa Fluor 633 exhibits uncommon photostability, making it an ideal choice for fluorescent microscopy.A great number of different Alexa Fluor dyes exist that are beyond the scope of this introductory fluorophore section. Many manufacturers sell directly-conjugated Alexa Fluor antibodies. Know that Molecular Probes' Zenon Antibody Labeling Kits, which are available for all of their Alexa Fluor dyes, make it possible to rapidly and quantitatively label antibodies from a purified antibody fraction or from a crude antibody preparation such as serum, ascites fluid or a hybridoma supernatant. See /servlets/publications?id=150 for specifics.Allophycocyanin (APC) is an accessory photosynthetic pigment found in blue-green algae. APC has 6 phycocyanobilin chromophores per molecule, which are similar in structure to phycoerythrobilin, the chromophore in phycoerythrin or PE. APC tandem dyes, APC-Cy5.5 and APC-Cy7, are also available. APC has a 650-nanometer wavelength absorption maximum and a 660-nanometer fluorescence emission maximum. APC can be used in flow cytometers equipped with dual lasers for multi-color analysis. Like Alexa Fluor 633, APC is excited using the helium-neon red diode laser (633 nanometers) of the FACSCalibur and is detected on the FL4 detector. APC cannot be detected on the FACScan as that instrument is not equipped with a red laser.APC-Cy7 is a tandem conjugate system that combines APC and a cyanine dye (Cy7) and has an absorption maximum at~650 nanometers. This tandem uses the efficiency of the fluorescence light energy transfer between the two fluorochromes. When excited by light from a helium-neon laser, the excited fluorochrome (APC) is able to transfer its fluorescent energy to the cyanine molecule, which then fluoresces at a longer wavelength. The resulting fluorescent emission maximum is in the deep red at approximately 767 nanometers. APC-Cy7 run on a FACSCalibur results in dim expression because the FL4 detector's optical filter is centered for APC emission (660 nanometers) and not the longer red wavelengths excited with the helium-neon diode. It is recommended that special precautions be taken with this conjugate, and cells stained with them, to protect the fluorochrome from long-term exposure to visible light.Carboxyfluorescein Diacetate (CFSE) can be used to track asynchronous cell division. Cell division results in sequential halving of the initial fluorescence, resulting in a cellular fluorescence histogram.The peaks labeled 1, 2, 3, 4 and 5 represent successive generations of CFSE-cultured cells.Cy3 and Cy5 are excited by the 488-nanometer line of an argon laser and the 633-nanometer line of a helium-neon diode or laser, respectively. These conjugates can be used in flow cytometry but typically do not give the fluorescence intensity comparable to that of PE or APC. Applications where a smaller dye is required are more appropriate for these dyes. These fluorochromes are well suited for fluorescent microscopy.Enhanced Cyan Fluorescent Protein (eCFP) cannot be analyzed using the FACScan or FACSCalibur as this molecule requires excitation in the violet range. The protein is easily detected using the violet laser of the LSRII, or the violet lines of the MoFlo's argon or krypton lasers. This molecule has an excitation maximum at 475 nanometers and is best excited using the MoFlo's 457nm line of the argon or argon-krypton mixed gas laser. Use of the 407nm violet laser of the LSRII will result in weak eCFP expression. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins.Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) can be excited at 488 nanometers with a peak emission at 509 nanometers and is detected in the FL1 detector on the FACSCalibur or FACScan. The MoFlo and LSRII are able to distinguish between concurrently expressing eGFP and eYFP cells if the proper optical filters and experimental controls exist. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins. Enhanced Yellow Fluorescent Protein (eYFP), a yellow-shifted variant of the eGFP molecule, is also excited at 488 nanometers with a peak emission at 535 nanometers and is also detected in the FL1 detector on the FACSCalibur or FACScan. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins.Fluorescein isothiocyanate (FITC) is currently the most commonly used fluorescent dye for flow cytometry analysis. When excited at 488 nanometers, FITC has a green emission that's usually collected at 530 nanometers, the FL1 detector of the FACSCalibur or FACScan. FITC has a high quantum yield (efficiency of energy transfer from absorption to emission fluorescence) and approximately half of the absorbed photons are emitted as fluorescent light. For fluorescent microscopy applications, FITC is seldom used as it photobleaches rather quickly though in flow cytometry applications, its photobleaching effects are not observed due to a very brief interaction at the laser intercept. FITC is highly sensitive to pH extremes.Peridinin chlorophyll protein (PerCP) has a 677 nanometer maximum emission, red, when excited at 488 nanometers and is detected on the FL3 detector of the FACSCalibur or FACScan. A PerCP tandem dye is also available (PerCP-Cy5.5). PerCP is not suited for the high-powered lasing (>150mW) applications, such as on the MoFlo, due to its photobleaching characteristics. PerCP conjugates can only be obtained from Becton Dickinson and its subsidiary, Pharmingen. Phycoerythrin (PE or R-PE) has a huge absorption coefficient and almost perfect quantum efficiency. In vivo, it functions to transfer light energy to chlorophyll during photosynthesis. It is one of the brightest dyes used today and emits in theyellow/orange at about 570 nanometers. Those accustomed to fluorescent microscopy may not be familiar with this fluorochrome as it photobleaches rather quickly under a microscope.Phycoerythrin-Cy5 (PE-Cy5) is a tandem conjugate where PE is coupled to the cyan dye, Cy5. When excited by 488-nanometer light, the excited fluorochrome (PE) is able to transfer its fluorescent energy to the cyanine molecule, which then fluoresces at a longer wavelength in the red at 670 nanometers. This tandem dye is known by a confusing myriad of names to include Becton Dickinson's CyChrome, Caltag and Sigma's Tri-Color, GIBCO's RED670, Coulter's PC5, and probably others. Other PE conjugates exist, e.g., PE-Cy5.5 and PE-Cy7, that will not be discussed in this introductory fluorophore section. It is recommended that special precautions be taken with this conjugate, and cells stained with them, to protect the fluorochrome from long-term exposure to visible light.Phycoerythrin-Texas Red (PE-Texas Red) is a tandem conjugate where PE is coupled to Texas Red. Similar to other tandem conjuates, when excited by 488-nanometer light, the excited fluorochrome (PE) is able to transfer its fluorescent energy to the Texas Red molecule, which then fluoresces at a longer wavelength with a peak in the orange at 612 nanometers. This tandem is also known by other names such as Red 612 and ECD (Electron Coupled Dye). Know that PE-Texas Red conjugates run on the FACScan or FACSCalibur will result in dull expression due to the extant optical filters. This is not observed on the LSRII or MoFlo when equipped with the appropriate optical filters for this conjugate. There is considerable overlap of emission when running PE and PE-Texas Red specimens.Propidium Iodide (PI) is a membrane-impermeant dye that stains by nondiscriminately intercalating into every 4th or 5th nucleic acid base pair, binding both DNA and RNA. Once bound, PI undergoes a conformational change and becomes ~40 times brighter. Propidium iodide has a broad emission spectrum with a peak in the orange at 620 nanometers. A number of assays employ propidium iodide. Cells or nuclei with altered DNA content are identified by staining alcohol-fixed, RNAse-treated cells or nuclei with this dye (see below).The first peak (M1) on the left represents normal diploid cells. The next major peak (M2) represents tumor cells with increased DNA content and DNA index of 1.27. Propidium iodide can be combined with additional fluorescent antibodies that are specific for a unique cell population and allow for more accurate S phase analysis of multiple overlapping populations.Propidium iodide has also been employed for many years as a marker for viability as the disrupted membranes of dead cells allow the dye to pass freely to the nucleic acids. However, this dye is very sticky; it will stick to sample tubing and, given sufficient time exposure to living cells, living cells will appear to be propidium iodide positive. Given this dye's broad emission spectrum and its sticky properties, contemporary flow cytometry labs have replaced propidium iodide with other nucleic acid dyes, e.g., 7-AAD (listed below), TO-PRO-3, or DAPI, among many others, for viability measurements though propidium iodide remains the most commonly used dye for DNA content analysis.Texas Red has an excitation maximum in the yellow-orange range of the color spectrum; consequently, Texas Red cannot be excited on any of the benchtop analyzers in the core facility. It can, however, be detected using one of green laser lines of the MoFlo's argon laser but ideally using the yellow laser line of the MoFlo's krypton laser. When excited, Texas Red has an excitation maximum in the orange at 612 nanometers.7-Aminoactinomycin D (7-AAD), like propidium iodide, is a DNA intercalating dye but 7-AAD is specific for C-G base pairs. It is well suited for viability measurements and also for apoptosis experiments where it's paired with Annexin V. Unlike propidium iodide, this dye has minimal emission bleed from the FL3 detector into the FL2 (PE) detector on the FACSCalibur or FACScan. Whereas PI can be detected in either FL2 or FL3, though it is typically detected in FL2, of the FACScan or FACSCalibur, 7-AAD is detected in FL3.PE：Phycoerythrin 藻红蛋⽩；488nm，575nm（橙红）FITC，异硫氰酸荧光素 488nm，525nm（绿APC：英⽂全名：allophycocyanin，中⽂名：别藻青蛋⽩，最⼤吸收峰：650nm，最⼤发射荧光峰：660nm，适⽤于双激光流式仪，可被600-640nm波长的激光激发。
流式细胞术免疫标记简介完整
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CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B 细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。
对中国人而言，CD19是特异性和敏感性最 高的。
CD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞 表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即 表达，持续存在直至B细胞终末阶段
外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板 表面不表达CD19。
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流式细胞术系列讲座之——免疫标记
流式细胞术免疫标记应用简介
1
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上次流式细胞术讲座内容（概述）
流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用
2
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流式细胞仪可检测的细胞参数
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周
期 RNA含量
细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性
的祖细胞。
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T细胞标志
T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、
CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，
且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞
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二、主要试剂： MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)， 其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 3、FACSLysing Solution 三、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： • 标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。 • A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL； • A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。 • A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。 • 置室温，避光孵育15min。 • 加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 • 300g离心5min，弃上清液。 • PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 • 1%多聚甲醛0.5mL。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。
流式细胞术免疫标记简介(完整)
T细胞标志
T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、
CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，
且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞
表面标志需经历一定的变化过程。
如与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。
流式细胞术表面分子免疫标记操作举例
淋巴细胞亚群检测操作程序
一、实验原理：
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为 三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋 巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞 表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体 与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把 淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。
（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得 PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表 达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原 消失。CD79仍可存在于胞质中。
B细胞上的CD抗原分为：
①B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、 CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限 于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。
（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟 B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞， 继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激 活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相 关 抗 原 如 CD25 、 CD26 、 CD30 、 CD69 、 CD70 、 CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型 Ig逐渐增加。
流式细胞基本知识
流式细胞基本知识anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a，所以可以用purified（纯化的） mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Control）。
一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。
同型对照：是指与 MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。
主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。
此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。
3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙.在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下：（1）钙荧光探针负载；（2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F值。
（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵育1~10min，测定荧光即Fmax值。
（4）加入EGTA，20μl（钙螯合剂），孵育1~10min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin值。
这个过程中的氯化钙的作用如何，请高人指点，谢谢。
因为正常血浆中Ca2＋浓度是1mM，细胞外液的Ca2＋对细胞内Ca2＋有影响。
加0.1%triton是增加膜通透性，使细胞外Ca2＋进入细胞内，作为最大值。
加EGTA是为了螯合Ca2＋，作为最小值.生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液（大约1：10000），细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大。
4、流式与werstern的区别，知道一些，不足之处请大家补充：（1）Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的；（2）Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50（很浪费抗体）；（3）采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，而流式一般要把每个样品分为两份，同时都做只加二抗（FITC标记的）的对照，这样平均到每个细胞的发光就不用内参了；（4）就个人经验而言，流式用多抗不好，单抗标出来不错。
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496, 565 514 496, 565 482 496, 565 482 496, 565 496, 565
488 488, 514 488 488 488 488 488 488 595, 633, 635, 647 633, 635 595, 633, 635, 647 595, 633, 635, 647 633, 635 595, 633, 635, 647 595, 633, 635, 647
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647 FL-3 FL-3 FL-3 PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5
PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5
FL-3 FL-3
FL-3 FL-3
FL-4 FL-4
PE/Cy5 PE/Cy5
FL-4 FL-4
PM-2 PM-1
PE-Cy5 PE-TR
FL-3 FL-2
Channel 5 Channel 5
® ® ®
377 401 410 458 400 400 495 493
360, 405, 407 360, 405, 407 360, 405, 407 405, 407, 457 405, 407 360, 405, 407 488 488
420 421 455 489 550 551 519 525
Fluorochromes for Flow Cytometry and Microscopy
Excitation Laser Lines (nm) BD BD BD BD FAC- BD FACSVanFACFACFACSCanto™ SCalibur™ tage™SE Scan™ SCanto™ II Beckman Coulter® EPICS® XL™/ XL-MCL™ Beckman CYTOPEIA Dako CyAn™ Coulter® FC Dako MoFlo® Guava EasyCyte iCyt Reflection® inFlux™ ADP 500 Amnis ImageStream®
575 FL-2 566 670 675 690 690 613 774 FL-2 FL-3 FL-3 FL-3 FL-3 FL-2 FL-3 FL-3 FL-2 FL-2 FL-3 FL-3 FL-3 FL-3 PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5 PE PE/Cy7 PE/Cy7 PE PE PE/Cy5 PE/Cy5 PerCP/ Cy5.5 PerCP/ Cy5.5 PE PE PE PE PE/Cy5 PE/Cy5 PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5 PE PE/Cy7 PE PE PE/Cy5 PE/Cy5 PerCP/ Cy5.5 PerCP/ Cy5.5 PE PE/Cy7 FL-2 FL-2 FL-4 FL-4 FL-4 FL-4 FL-3 FL-2 FL-2 FL-4 FL-4 FL-4 FL-4 FL-3 FL-5 FL-4 FL-4 FL-6 FL-6 FL-6 FL-6 FL-5 PE PE PE/Cy5 PE/Cy5 PE/Cy5 PE/Cy5 PE/Texas Red PE/Cy7 FL-3 FL-5 PM-4 FL-4 FL-2 FL-2 FL-4 PM-1 PM-1 PM-2 PM-2 PM-2 PM-2 PE PE PE-Cy5 PE-Cy5 PE-Cy5.5 PE-Cy5.5 PE-TR PE-Cy7 FL-3 FL-2 FL-2 FL-3 FL-3 FL-3 FL-3 Channel 4 Channel 4 Channel 6 Channel 6 Channel 6 Channel 6 Channel 5
FL-1 FL-1 FL-1 FL-1 FL-2 FL-2 FL-3 FL-3
DAPI DAPI DAPI DAPI Pac. Orange Pac. Orange FITC FITC
FL-6 FL-6 FL-6 FL-6 FL-7 FL-7 FL-1 FL-1 PM-3 PM-3
DAPI/PacBlue DAPI/PacBlue DAPI/PacBlue DAPI/PacBlue Pac. Orange Pac. Orange FITC FITC FL-1 FL-1
305, 540
325, 360, 488
620
FL-3
Trademarks: BD FACScan™ , BD FACSCaliber™, BD FACSVantage™ SE, BD FACSCanto™, BD™ LSRII, BD FACSAria™ are trademarks of Becton, Dickinson and Company. Coulter® EPICS® XL™/XL-MCL™ are registered trademarks of Beckman Coulter, Inc. inFlux™ is a trademark of Cytopeia, Inc. iCyt Reflection® is a registered trademark of iCyt Mission Technology, Inc. CyAn™ ADP and MoFlo™ are trademarks of Dako Denmark A/S. C6™ is a trademark of Accuri. Image Stream® is a registered trademark of Amnis Corporation. Cascade Blue®, Alexa Fluor® , Texas Red® are registered trademarks of Molecular Probes, Inc. Pacific Blue™ is a trademark of Molecular Probes, Inc. * These fluorochromes can be used as single color configurations or multi-colored configurations depending on instruments, available lasers and filters, and appropriate color compensation settings. ** These instruments are provided as general information. User must check instrument capability and choose appropriate setting.
359
325, 360, 405, 407 488
461
DAPI PerCP/ Cy5.5 PerCP/ Cy5.5
DAPI
DAPI PerCP/ Cy5.5 PerCP/
DAPI/PacBlue
Channel 2
DAPI 7-AAD (7aminoactinomycin D) PI (Propidium Iodide)
Channel 2 Channel 2 Channel 2 Channel 2
Cascade Blue® Alexa Fluor® 405 Pacific Blue™ AmCyan Cascade Yellow™ Pacific Orange™
Channel 3 Channel 3
Alexa Fluor® 488 FITC (fluorescein) PE (RPhycoerythrin) Cy3 PE/Cy5 PerCP PE/Cy5.5 PerCP-Cy5.5 PE/Texas Red® PE/Cy7 APC (allophycocyanin) Cy5 Alexa Fluor® 647 APC/Cy5.5 Alexa Fluor® 700 APC/Cy7 APC/Alexa Fluor® 750 Viability Probe
Fluorochrome
Excitation Max (nm)
Emission Max (nm)
BD™
LSR II
BD FACSAria™
Accuri C6™ Flow Cytometer
Fluorochrome
Cascade Blue® Alexa Fluor® 405 Pacific Blue™ AmCyan Cascade Yellow™ Pacific Orange™ Alexa Fluor 488 FITC (fluorescein) PE (RPhycoerythrin) Cy3 PE/Cy5 PerCP PE/Cy5.5 PerCP-Cy5.5 PE/Texas Red® PE/Cy7 APC (allophycocyanin) Cy5 Alexa Fluor 647 APC/Cy5.5 Alexa Fluor 700 APC/Cy7 APC/Alexa Fluor® 750 Viability Probe DAPI 7-AAD (7aminoactinomycin D) PI (Propidium Iodide)