QPCR技术细节解析
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细节决定成败
QPCR的技术细节对实验结果的影响
程涛 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所
内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
荧光定量PCR原理
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循 环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起 始模板进行定量分析 与常规 PCR技术比较：
误差分析及操作规范
4. 部分样本扩增效率过低
原因：① 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；② 反应液未严格取量混匀或分装不 均匀；③试剂失效；
误差分析及操作规范
5. 阴性对照或空白对照翘尾
原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；
ຫໍສະໝຸດ Baidu
误差分析及操作规范
6. 直线型扩增曲线
3’淬灭基 团 TAMRA
淬灭基团性 质 荧光物质
建议使用的5’报告基团
FAM, HEX, TET, JOE等 FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX等
Eclipse
非荧光物质
Taqman探针法——优缺点
优 点
高度特异性 重复性好 可进行多重定量
缺 点
RT
模板准备 上机 数据分析
试剂选择
误差控制 技能要求
仪器软件
SYBR法实验流程及注意事项
样品制备 环境要求
浓度确定
分光光度计检测 电泳检测
RT
模板准备 上机
无RNase环境 使用无RNase耗材 专用RNase-free工具
高纯度，浓度均一的RNA
数据分析
SYBR法实验流程及注意事项
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
不同定量方法的比较
方法 优点 缺点 适用范围
适用性广 SYBR Green I 灵敏 方法 方便 便宜
适合科研中对各种目的 引物要求高 基因定量分析，基因表 易出现非特异性 达量的研究，转基因重 带 组动植物的研究 不能进行多重定 量
病原体检测，疾病耐药 基因研究,药物疗效考 TaqMan 方法 重复性好 只适合特定目标 核 遗传疾病的诊断 多重定量 特异性高 价格高
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
SYBR法实验流程及注意事项
引物设计 样品制备 环境要求
浓度确定 反应体系优化 反应条件优化 分析方法
内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
绝对定量解析方法
绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的
标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系
原因：① 反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖， 使得光线突然增强；③ 如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；
SYBR法实验流程及注意事项
样品制备 可靠，准确的数据
RT
相对定量：2
－△△Ct
法
绝对定量：标准曲线法
模板准备 上机
分析方法
数据分析
软件系统
Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩 增产物的荧光信号达到 设定的阈值时所经过的 扩增循环次数
Rn（荧光强度）
Ct value
Cycle（循环数）
荧光定量PCR原理－－荧光阈值
前15个循环信号作为荧 光本底信号（baseline）
荧光阈值的缺省设置是 3～15个循环的荧光信号的 标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背 景值和阴性对照的荧光最 高值；进入指数期的最初 阶段 真正的信号:荧光信号 超过阈值
样品制备
RT
反应体系优化
下游反应数确定反转录体积 选择应用引物
试剂选择
模板准备 上机 数据分析
AMV M-MLV Quant Super
高效、全长的cDNA
GC％：50－60％ Tm：55－60℃
单个碱基重复＜4个
引物设计
无二级结构 引物位置
扩增长度：50－150bp
样品制备
RT
模板准备 上机
环境要求
核酸制备区 反应液制备区
浓度确定
制作标准曲线 设定浓度区间 评价引物
误差控制
使用mix降低系统误差 设置重复（≥3次） 设置空白和阴性对照
均一的反应液和模板 混合物 数据分析
SYBR法实验流程及注意事项
标 准 品 待测样本 阳性对照
Taqman探针法——工作机理
探 针 热变性 引物
报告基团
R
淬灭基团
引物和探针与模板退火 DNA聚合酶 延伸反应
R
探针
R
R
Taqman探针法——PCR体系的建立
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
常用荧光标记方法
非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe
SYBR Green I染料法——原理
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。
优 点
对DNA模板没有选择性 使用方便，不必设计复杂探针
缺
点
容易产生假阳性 对引物特异性要求较高
具有价格优势
不能进行多重定量
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起 始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
荧光定量PCR原理
扩增曲线 荧光阈值 Ct值
PCR产物的积累规律
在PCR反应中， DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。
反应初期，目的 DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产 物逐渐积累，在引物一模板与 DNA聚合酶达到一定比例时， 酶的催化反应趋于饱和，此时扩增 DNA片段的增加减慢进入 相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需 PCR 循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、 DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的 竞争等因素。到达平台期前， TaqDNA 聚合酶一般要进行 25 次以上PCR循环。
SYBR Green I染料法——融解曲线
原始图谱
对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
SYBR Green I染料法——融解曲线
融解曲线分析，单一 峰无非特异性荧光 定量准确
融解曲线分析，出现杂 峰其他产物出现非特异 性荧光，因此定量不准 确
SYBR Green I染料法——优缺点
反应体系优化
数据分析
SYBR法实验流程及注意事项
内参控制 机器校正控制
平滑曲线，重复性好， 样品制备 灵敏度高
RT
模板准备
自配 DBI Real mastermix
分装控制
试剂选择
Roche-Lightcycler series ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series ABI-7series Bioer－Linegene series
荧光定量PCR反应性的确认
线性关系、扩增效率确认
相关系数（r2）：大于0.98 PCR扩增效率（E）:0.9-1.1
检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles 内无非特异性产物扩增
No Template Control(NTC)确认
35 Cycles内无引物二聚体产生
样品制备
退火温度优化：梯度PCR 延伸时间：产物长度决定 扩增效率：90％－110％ 重复性：std＜0.2 标准曲线：R＞0.99或R2 ＞0.98
阴性对照
RT
模板准备
反应条件优化
上机
反应体积＞5ul，推荐20－50ul Mg2＋调节，酶活调节 引物浓度优化，模板量优化
SYBR Green I
SYBR Green I染料法——作用机理
热变性
引物退火
延伸反应
SYBR Green I染料法——问题点与关键点
问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因 此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生， 也将 同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。 关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高）， 也可通过温度梯度优化退火温度
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同
Taqman探针法——荧光标记物的选择
原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存 至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制 物；
误差分析及操作规范
7.山坡形曲线
原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。
误差分析及操作规范
8.扩增曲线断裂
原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致， 因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过 高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据
误差控制 上机 数据分析 技能要求
Real-time PCR体系优化
扩增曲线 溶解曲线
45oC
55oC
1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. 83oC for 1 sec 6. Plate Read 7. Go to line 2 39 more times 8. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
PCR产物的积累规律示意图
荧光定量PCR定量原理
扩增曲线
荧光定量PCR定量原理
为 什 么 终 点 定 量 不 准 确 呢 ？
荧光定量PCR定量原理
尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cycle threshold）与模板起始浓度有密切联系。
荧光定量PCR原理－－Ct值
65oC
误差分析及操作规范
同一cDNA样品的三个重复
误差分析及操作规范
1. 模板浓度越低，染料法的误差越大
如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但 是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引 物二聚体引起的误差非常严重。
误差分析及操作规范
误差分析及操作规范
9.基线下滑
原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；
误差分析及操作规范
10.没有扩增曲线
原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步， 即stage 1阶段；②电脑设定了自动休眠；
误差分析及操作规范
11. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰
定量PCR的数学原理
定量PCR的数学原理
定量PCR的数学原理
定量PCR的数学原理
Sample
Ck 104 Ck 102
模板DNA量越多，荧光达到 域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线 性关系。
Cycle number Log of DNA concentration
2. 某一孔荧光信号特别强
原因：① 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多； ② 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同； ③ 也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；
误差分析及操作规范
3.样品浓度跨度过大
样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，
QPCR的技术细节对实验结果的影响
程涛 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所
内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
荧光定量PCR原理
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循 环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起 始模板进行定量分析 与常规 PCR技术比较：
误差分析及操作规范
4. 部分样本扩增效率过低
原因：① 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；② 反应液未严格取量混匀或分装不 均匀；③试剂失效；
误差分析及操作规范
5. 阴性对照或空白对照翘尾
原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；
ຫໍສະໝຸດ Baidu
误差分析及操作规范
6. 直线型扩增曲线
3’淬灭基 团 TAMRA
淬灭基团性 质 荧光物质
建议使用的5’报告基团
FAM, HEX, TET, JOE等 FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX等
Eclipse
非荧光物质
Taqman探针法——优缺点
优 点
高度特异性 重复性好 可进行多重定量
缺 点
RT
模板准备 上机 数据分析
试剂选择
误差控制 技能要求
仪器软件
SYBR法实验流程及注意事项
样品制备 环境要求
浓度确定
分光光度计检测 电泳检测
RT
模板准备 上机
无RNase环境 使用无RNase耗材 专用RNase-free工具
高纯度，浓度均一的RNA
数据分析
SYBR法实验流程及注意事项
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
不同定量方法的比较
方法 优点 缺点 适用范围
适用性广 SYBR Green I 灵敏 方法 方便 便宜
适合科研中对各种目的 引物要求高 基因定量分析，基因表 易出现非特异性 达量的研究，转基因重 带 组动植物的研究 不能进行多重定 量
病原体检测，疾病耐药 基因研究,药物疗效考 TaqMan 方法 重复性好 只适合特定目标 核 遗传疾病的诊断 多重定量 特异性高 价格高
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
SYBR法实验流程及注意事项
引物设计 样品制备 环境要求
浓度确定 反应体系优化 反应条件优化 分析方法
内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
绝对定量解析方法
绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的
标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系
原因：① 反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖， 使得光线突然增强；③ 如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；
SYBR法实验流程及注意事项
样品制备 可靠，准确的数据
RT
相对定量：2
－△△Ct
法
绝对定量：标准曲线法
模板准备 上机
分析方法
数据分析
软件系统
Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩 增产物的荧光信号达到 设定的阈值时所经过的 扩增循环次数
Rn（荧光强度）
Ct value
Cycle（循环数）
荧光定量PCR原理－－荧光阈值
前15个循环信号作为荧 光本底信号（baseline）
荧光阈值的缺省设置是 3～15个循环的荧光信号的 标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背 景值和阴性对照的荧光最 高值；进入指数期的最初 阶段 真正的信号:荧光信号 超过阈值
样品制备
RT
反应体系优化
下游反应数确定反转录体积 选择应用引物
试剂选择
模板准备 上机 数据分析
AMV M-MLV Quant Super
高效、全长的cDNA
GC％：50－60％ Tm：55－60℃
单个碱基重复＜4个
引物设计
无二级结构 引物位置
扩增长度：50－150bp
样品制备
RT
模板准备 上机
环境要求
核酸制备区 反应液制备区
浓度确定
制作标准曲线 设定浓度区间 评价引物
误差控制
使用mix降低系统误差 设置重复（≥3次） 设置空白和阴性对照
均一的反应液和模板 混合物 数据分析
SYBR法实验流程及注意事项
标 准 品 待测样本 阳性对照
Taqman探针法——工作机理
探 针 热变性 引物
报告基团
R
淬灭基团
引物和探针与模板退火 DNA聚合酶 延伸反应
R
探针
R
R
Taqman探针法——PCR体系的建立
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
常用荧光标记方法
非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe
SYBR Green I染料法——原理
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。
优 点
对DNA模板没有选择性 使用方便，不必设计复杂探针
缺
点
容易产生假阳性 对引物特异性要求较高
具有价格优势
不能进行多重定量
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起 始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
荧光定量PCR原理
扩增曲线 荧光阈值 Ct值
PCR产物的积累规律
在PCR反应中， DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。
反应初期，目的 DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产 物逐渐积累，在引物一模板与 DNA聚合酶达到一定比例时， 酶的催化反应趋于饱和，此时扩增 DNA片段的增加减慢进入 相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需 PCR 循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、 DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的 竞争等因素。到达平台期前， TaqDNA 聚合酶一般要进行 25 次以上PCR循环。
SYBR Green I染料法——融解曲线
原始图谱
对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
SYBR Green I染料法——融解曲线
融解曲线分析，单一 峰无非特异性荧光 定量准确
融解曲线分析，出现杂 峰其他产物出现非特异 性荧光，因此定量不准 确
SYBR Green I染料法——优缺点
反应体系优化
数据分析
SYBR法实验流程及注意事项
内参控制 机器校正控制
平滑曲线，重复性好， 样品制备 灵敏度高
RT
模板准备
自配 DBI Real mastermix
分装控制
试剂选择
Roche-Lightcycler series ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series ABI-7series Bioer－Linegene series
荧光定量PCR反应性的确认
线性关系、扩增效率确认
相关系数（r2）：大于0.98 PCR扩增效率（E）:0.9-1.1
检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles 内无非特异性产物扩增
No Template Control(NTC)确认
35 Cycles内无引物二聚体产生
样品制备
退火温度优化：梯度PCR 延伸时间：产物长度决定 扩增效率：90％－110％ 重复性：std＜0.2 标准曲线：R＞0.99或R2 ＞0.98
阴性对照
RT
模板准备
反应条件优化
上机
反应体积＞5ul，推荐20－50ul Mg2＋调节，酶活调节 引物浓度优化，模板量优化
SYBR Green I
SYBR Green I染料法——作用机理
热变性
引物退火
延伸反应
SYBR Green I染料法——问题点与关键点
问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因 此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生， 也将 同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。 关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高）， 也可通过温度梯度优化退火温度
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同
Taqman探针法——荧光标记物的选择
原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存 至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制 物；
误差分析及操作规范
7.山坡形曲线
原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。
误差分析及操作规范
8.扩增曲线断裂
原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致， 因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过 高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据
误差控制 上机 数据分析 技能要求
Real-time PCR体系优化
扩增曲线 溶解曲线
45oC
55oC
1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. 83oC for 1 sec 6. Plate Read 7. Go to line 2 39 more times 8. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
PCR产物的积累规律示意图
荧光定量PCR定量原理
扩增曲线
荧光定量PCR定量原理
为 什 么 终 点 定 量 不 准 确 呢 ？
荧光定量PCR定量原理
尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cycle threshold）与模板起始浓度有密切联系。
荧光定量PCR原理－－Ct值
65oC
误差分析及操作规范
同一cDNA样品的三个重复
误差分析及操作规范
1. 模板浓度越低，染料法的误差越大
如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但 是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引 物二聚体引起的误差非常严重。
误差分析及操作规范
误差分析及操作规范
9.基线下滑
原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；
误差分析及操作规范
10.没有扩增曲线
原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步， 即stage 1阶段；②电脑设定了自动休眠；
误差分析及操作规范
11. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰
定量PCR的数学原理
定量PCR的数学原理
定量PCR的数学原理
定量PCR的数学原理
Sample
Ck 104 Ck 102
模板DNA量越多，荧光达到 域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线 性关系。
Cycle number Log of DNA concentration
2. 某一孔荧光信号特别强
原因：① 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多； ② 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同； ③ 也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；
误差分析及操作规范
3.样品浓度跨度过大
样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，