实验10 病毒血凝和血凝抑制试验

(四)红细胞凝集试验
1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12 孔。 2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准 病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍 比稀释至第11孔，弃去50μl，12孔为阴性对照。 3、加50μl的1%鸡红细胞于每一孔，按病毒的低浓度 至高浓度加入。 4、混匀、室温静止30min 。 5、确定红细胞100%凝聚的病毒的最高稀释度，为 HA滴度。
质粒DNA
3条带不是超螺旋、线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA， 其实这三条带以电泳速度的快慢而排序， 分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没 有复制完全的两个质粒连在了一起）。
病毒的血凝和血凝抑制
一 实验目的 1:学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集 2: 掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本 操作 3 ：理解病毒血凝和血凝抑制试验的应用
DNA电泳
取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液（甘油， 溴酚蓝，DNA稳定剂）混合后，用微量取样器慢 慢将混合物加至样品孔中。 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据DNA的大 小、1kb和3kb左右的指示剂来判断）后，切断电 源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照记录 结果，估测质粒分子量的大小。
(六)病毒的红细胞凝集抑制试验 1、加生理盐水50μl于96孔板的一排的1-12孔。 2、加标准血清50μl于一排第一孔，倍比稀释到第11孔， 弃50μl。 3、将50μl病毒的4个血凝单位抗原加至1到第11孔。 4 、然后加 50μl 的 1%鸡红细胞至各孔，混匀，室温静置 30min 。 5、观察结果，确定血清的HI效价。血凝被抑制的抗体最 高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（HI效价）。
载样缓冲液
其中含有的甘油可以使待电泳样品沉在 点样孔底部，避免样品漂浮 其中含有的溴酚蓝（某些还含有二甲苯 青）可以作为电泳速度度的指示分子， 溴酚蓝的迁移位置大约相当于200 bp左 右的线性DNA分子的迁移位置。
溴化乙锭
溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个 三环平面基团。它与DNA的结合无特异性。当染料分 子插入后，导致与DNA结合的染料呈现荧光，DNA吸 收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染 料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下 ，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处发射出 来。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA ）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其 荧光产率也相对较低。 有一些低毒产品替代：sybr green、sybr gold、gene finder
6、血凝效价（HA）的确定
将板直立，首先观察红细胞阴性对照， 应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附 于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即 为血凝效价。
(五) 4单位病毒液的配制
以出现红细胞凝集现象的最高稀释 度为1个单位,将原病毒液稀释成4倍于最高 稀释度的病毒液,即为4单位病毒液.例如: 出现红细胞凝集现象的最高稀释度是2的9 次方(病毒的血凝效价为2的9次方),那么, 4单位病毒液就为2的7次方.
实验九 质粒电泳 病毒的血凝和血凝抑制
原理
与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。 在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷 酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带 正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为 8.0~8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带负电荷，向正极移动。 用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥 分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的 。
Leabharlann Baidu 二
实验原理
1:红细胞凝集 某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹 病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些 动物的红细胞表面的相应受体结合，从而呈 现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是 配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相 应抗体作用的凝集反应。 这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的
2:红细胞凝集抑制 当病毒被相应抗体中和后，则丧失了凝集红 细胞的功能，即病毒的红细胞凝集特性被抑 制。 3:利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验 鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也 可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制 试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫 效果，或动物是否受到病毒感染 血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验
实验报告
实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题 某一病毒能够引致血凝，是否可以判定它是何种 病毒？如果不行，应该再要进行什么实验？为什么？ 下次实验
血清学试验（凝聚试验和ELISA)p163,171
4 红细胞的解脱现象 某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨 酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下 来，因此，血凝试验的时间太长，可能会 在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实 验过程中必须控制好时间。
三 实验操作
(一)病毒的鸡胚接种与培养 (二)病毒尿囊液的收集 37度培养72小时的鸡胚--放置于4度冰箱,致 死鸡胚--消毒气室--用镊子打开气室-打开壳膜--用 移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升离心管--5000 转,离心5分钟,以去除细胞沉淀--上清液供血凝 和 血凝抑制试验作用. (三)制备1%浓度的鸡红细胞 采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗3次,每次离 心5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成 1%浓度.
电泳准备
用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放臵电泳梳子。 用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1×TAE–buffer)，在微波炉中加热至 琼脂糖溶解。待溶液冷却至60℃，加入适量 Goldview(或溴化乙锭)至微红，混匀。 将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在5-7mm 之间。 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板 移至装有1×TAE–buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳 子，且使缓冲液没过胶面。