实验10 病毒血凝和血凝抑制试验
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)资料
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
1.3 原理
血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:
痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而 是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。
流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细 胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
2、血凝抑制试验(HI)
2.1定义
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的 量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的 受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时 红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 (hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血 凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸
血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)
一、目的要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。 二、实验材料 1、禽流感毒 2、1%鸡红细胞 3、生理盐水 4、禽流感阳性血清 5、96孔“V”型微量反应板 三、实验内容 1、HA试验术式表： 2、HI试验术式表： 四、作业 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？ 2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么
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1： 2 1： 4 1： 8 ﹟ 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价
血凝抑制试验(HI)
一、概念： 1 、 HI 试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。 2、抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体 效价。
病毒的红细胞凝集试验（HA）
一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞 表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 二、应用 1 、当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明 该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。 2 、凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA试 验，出现血凝现象的各稀释孔中，以100%能出现病毒的红细胞凝集现象的 病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价(血凝价)
二、动物体内抗体存在情况 1、当动物感染某病毒而发病时，可在机体的相应器官查出病毒。
2、病毒相当于免疫效应物质中的抗原，病毒进入动物机体，将发生特异
性免疫反应，即产生免疫物质——抗体（ 90%抗体都存在于动物的血清 中），抗原和抗体发生特异性结合反应 3、病畜体内，因受病毒抗原刺激，产生大量相应抗体，故体内抗体效价 较高 4、健康动物，免疫接种后，因受疫苗（抗原）刺激，而发生免疫应答反 应，体内抗体效价较高
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验作者：陈美艳罗福斌任芬来源：《云南农业》 2020年第9期陈美艳1，罗福斌1，任芬2（1.新平县动物疫病预防控制中心，云南新平 653400；2.新平县畜牧站，云南新平653400）摘要：血凝、血凝抑制试验是目前兽医实验室用于禽疫苗免疫抗体水平监测技术。
试验通过首先制备红细胞沉降良好的分数为1%鸡红细胞悬液；其次抗原血凝效价准确；第三4HAU工作抗原配制；第四血凝抑制滴定读数准确。
关键词：4HAU抗原；血凝；血凝抑制血凝、血凝抑制试验是目前兽医实验室用于禽疫苗免疫抗体水平监测技术，也可用已知标准阳性血清（抗体）监测是否有该病毒（抗原）的存在。
实验室用血凝、血凝抑制试验检测鸡血清中禽流感和新城疫抗体，其血凝反应（HA）可以理解为，禽流感病毒和新城疫病毒或其血凝素能和鸡红细胞发生凝集反应致使红细胞不能自然沉降。
血凝抑制反应（HI）理解为，当禽流感和新城疫工作抗原和血清样品中抗体反应后，则红细胞就不能再与工作抗原发生反应，这时红细胞就呈现出自然沉降现象，当血清样品抗体不足以和工作抗原反应时，工作抗原就和红细胞发生凝集反应。
1 材料与方法1.1 供试材料和试剂96孔U型微量反应板、移液枪及配套滴头，禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H9亚型阳性血清、阴性血清、体积分数为1%鸡红细胞悬液、灭菌生理盐水和加样槽。
1.2 试验方法1.2.1红细胞沉降良好的体积分数为1%鸡红细胞悬液制备为避免出现红细胞自凝现象，一般选用至少3只健康公鸡分别采血，并清洗红细胞后配制成体积分数为10%红细胞悬液，最后配制成体积分数为1%红细胞悬液。
若1%鸡红细胞悬液用量大于100 mL时也可直接配制。
一般按照等比例混匀体积分数为1%鸡红细胞悬液，如在试验过程中遇到特殊情况，无法满足等量比例混合时也可适当调整比例。
整个试验过程只能使用同1份鸡红细胞悬液，并保持混匀以确保红细胞均匀；如有红细胞破裂或者被污染情况，试验无效。
血凝试验和血凝抑制试验的影响因素及应对措施
液 、 原 、 清等 ， 抗 血 如果 管嘴 接触 到孔 内混 合 液 ， 会造 成各 个 孔 内液体 相互 污染 。 以在使 用移 液器 时 ， 定要 保持 所 一 加样 器管嘴 与凝集 板孔 间的距离 ， 以保证每 个凝集 孔 内液 体数量 和浓度准确 。
摘 要 ： 绍 了血凝试验 （Ａ 和血 凝抑制试验 （Ｉ 中的常见 问题 ， 介 Ｈ） Ｈ） 主要 包 ： 照孔凝 集； 括 对 全部凝 集； 细胞 全部 下 红 沉； 标准 阳性对照血 清的抗体 效价与原 结果误 差大于 １ 个滴度 ； 泪滴状流 淌 （ 完全血 凝抑制） 细等； 线 结果 出现 慢或 结果 出现快 ， 且整板无凝 集现 象等 。 并 分析 了其影 响 因素 ， 并提 出了应对措 施 。
滴 度 ； ５） 状流淌（ （ 泪滴 完全 血凝抑 制） 细 ；６） 线 （ 结果 出现慢 或结果 出现快 ， 且整板 无凝集 现象 ；７） 并 （ 凝集 板 出现 跳孔 现 象 ； ８凝 集不 明显 ， （） 无法 判定结果 。
（） １在使用 微量 移液器 时 ， 液体 加入量 发生 误差 。 使 在
年公鸡 的血 ， 一般 要求 用非 免 疫公 鸡 ， 如果 用 免疫 公鸡 代 替 ， 应增加洗涤次 数和时 间。 但
ｌ 血凝试验 （Ａ 和 血凝抑制试验 （ 中的常见 问题 Ｈ） …）
血凝试 验（ Ａ） Ｈ 和血凝 抑制 试验（ ） ＨＩ 中的常 见 问题 主
（ ） 集板 不干 净 。 ４凝 目前 ， 验单位 和基 层多 使用一 次 实
而成为我 国各 地动物 防疫监督 机构和养殖场户 进行 流行病 学调查 、 免疫程序制定及 免疫效果监测 等的主要手段之 一。 尽 管此监测方法操作简便 、 快捷 、 准确 和实用 ， 但是在实践 中 由于某些 因素的影响， 导致试 验结果不 准确， 甚至无法判定 。 笔者根据多年的实践操作将实验中的影 响因素浅析如下。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。
正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。
各种病毒的血凝素性质不尽相同。
某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。
某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。
病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。
血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。
而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。
血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。
以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。
各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高压灭菌备用。
2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。
血凝、血凝抑制试验
⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。
清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。
在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。
使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。
现⽤现配。
4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。
血凝实验和血凝抑制实验报告
血凝实验和血凝抑制实验报告一、引言血液凝固是维持人体生命活动的重要生理过程之一。
当人体受到损伤时，血液会迅速凝固形成血块，以阻止出血。
然而，血液凝固过程的异常可能导致血栓形成，进而引发心脑血管疾病。
因此，准确评估血液凝固功能对于疾病预防和治疗至关重要。
二、血凝实验血凝实验是一种常用的临床实验方法，用于评估血液的凝固功能。
该实验主要通过测量血液在一定时间内凝固的程度来获得结果。
常见的血凝实验包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板计数和纤维蛋白原测定等。
1. 凝血酶原时间（PT）凝血酶原时间是评估外源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶原转化为凝血酶所需的时间来测定。
正常情况下，PT 的时间范围为11-13秒。
若PT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）活化部分凝血活酶时间是评估内源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶形成所需的时间来测定。
正常情况下，APTT 的时间范围为25-35秒。
若APTT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
3. 血小板计数血小板计数是评估血小板功能的指标。
血小板是血液中的细小细胞片段，主要参与血液凝固过程。
正常情况下，血小板计数在150-450×10^9/L之间。
若血小板计数过低，则可能导致出血倾向。
4. 纤维蛋白原测定纤维蛋白原是血液凝固过程中的重要物质，参与形成纤维蛋白凝块。
纤维蛋白原测定可以评估纤维蛋白原的含量。
正常情况下，纤维蛋白原的浓度在2-4 g/L之间。
若纤维蛋白原浓度过低，则可能导致凝血功能异常。
三、血凝抑制实验血凝抑制实验是一种检测血液凝固抑制功能的方法。
该实验主要评估抗凝血酶、抗纤维蛋白聚合酶等物质对血液凝固过程的抑制作用。
1. 抗凝血酶实验抗凝血酶是一种重要的抗凝物质，可以抑制凝血酶的活性。
抗凝血酶实验通过测定血浆中抗凝血酶的活性来评估抗凝血酶功能。
血凝抑制试验原理
血凝抑制试验原理
血凝抑制试验是一种检测抗凝血功能的实验方法。
其原理是通过观察某种物质对血液凝固过程的影响，来判断该物质的抗凝血效果。
在血凝抑制试验中，首先从受试者的静脉或指尖采集一定量的新鲜全血。
然后将血液放入一种试验管中，加入适量的抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠。
接下来，加入激动剂，如胶原或凝集素，以促使血液开始凝固。
同时，加入需要测试的抗凝物质。
血液开始凝固时，血小板会聚集并黏附在血管内壁上，最终形成血凝块。
然而，如果所加入的抗凝物质具有抗血凝的效果，它会阻止血小板的聚集和凝血因子的活化，从而抑制了血凝块的形成。
观察试管内的血液变化，若血液凝聚程度较低或完全没有凝结，则说明所测试的物质具有良好的抗凝效果。
相反，如果血液凝聚程度较高，则说明该物质对血凝过程没有明显的抑制作用。
血凝抑制试验广泛应用于临床诊断和药物研发领域。
通过检测不同物质对血液凝固的影响，可以评估患者的凝血功能，判断其是否存在凝血系统的异常。
同时，该试验也为开发新型抗凝药物和评估其抗凝效果提供了重要的参考依据。
血凝和血凝抑制试验
3. 4.
பைடு நூலகம்
0.85%生理盐水。 生理盐水。 生理盐水 被检血清，采自被检鸡的健康血清。 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、操作步骤
（一）血凝试验（HA） 血凝试验（ ）
1. 在血凝板第一排的 在血凝板第一排的1~12孔加入 孔加入50µl生理盐水。 生理盐水。 孔加入 生理盐水 2. 在第1孔中加入 病毒抗原， 在第 孔中加入50µl病毒抗原，反复吸取混匀 孔中加入 病毒抗原 后吸50µl到第 孔，如此倍比稀释直到第 孔， 到第2孔 如此倍比稀释直到第10孔 倍比稀释直到第 后吸 到第 混匀后弃50µl； 最后两孔 （ 11、 12） 为红细 ； 最后两孔（ 、 ） 混匀后弃 胞对照。 胞对照。
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25
弃 50µl /
50 / / 50
25 50
注： 11孔为病毒对照 应该完全凝集， 12孔为细胞对照 孔为病毒对照， 孔为细胞对照， 1) 第 11 孔为病毒对照 ， 应该完全凝集 ， 第 12 孔为细胞对照 ， 应该完全沉积到孔底，只有当对照成立时试验结果方有效。 应该完全沉积到孔底 ， 只有当对照成立时试验结果方有效。 以红细胞100 凝集的稀释度为判定终点。 100% 2) 以红细胞 100% 凝集的稀释度为判定终点 。 血凝抑制滴度大 于等于1 为阳性，小于1 为阴性，等于2 为可疑。 于等于1：24为阳性，小于1：22为阴性，等于23为可疑。
病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开， 2 ） 病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开 ， 血凝素呈游离状态，例如天花 牛痘、 天花、 血凝素呈游离状态，例如天花、牛痘、鼠痘等 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 3 ） 脑炎病毒 、 口蹄疫病毒等 ， 凝集红细胞的条 脑炎病毒、 口蹄疫病毒等， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 同时还要掌握反应的pH和温度等。 同时还要掌握反应的pH和温度等。 pH和温度等
血凝实验实验报告
一、实验目的1. 理解血凝现象的原理。
2. 掌握血凝实验的操作步骤。
3. 学习通过血凝实验判断血凝素和血凝抑制抗体的存在。
二、实验原理血凝现象是指某些病毒能够凝集动物红细胞的能力。
利用这一特性，可以通过血凝实验检测病毒的存在以及血清中抗体的水平。
血凝抑制试验（HI试验）是一种常用的血清学检测方法，通过检测血清中的血凝抑制抗体，可以判断感染状态、疫苗接种效果等。
三、实验材料1. 红细胞：鸡红细胞、兔红细胞等。
2. 病毒：流感病毒、副流感病毒等。
3. 血凝素（HA）：用于血凝实验。
4. 血凝抑制抗体（HI）：用于血凝抑制实验。
5. 实验器材：微量移液器、酶标板、振荡器、离心机等。
四、实验方法1. 血凝实验（1）将红细胞用生理盐水洗涤三次，制成1%的红细胞悬液。
（2）取96孔酶标板，每孔加入25μl PBS液。
（3）在第一孔中加入25μl病毒悬液，混匀后吸取25μl加到第二孔，依次倍比稀释至第二排最后一孔，弃去25μl。
（4）在每孔中加入25μl 1%红细胞悬液。
（5）将酶标板置于振荡器上振荡10秒，室温静置30min。
（6）观察结果，记录出现血凝现象的孔数。
2. 血凝抑制实验（1）取96孔酶标板，每孔加入25μl PBS液。
（2）在第一孔中加入25μl病毒悬液，混匀后吸取25μl加到第二孔，依次倍比稀释至第二排最后一孔，弃去25μl。
（3）在第三至第六排孔中加入不同浓度的血清。
（4）在每孔中加入25μl 1%红细胞悬液。
（5）将酶标板置于振荡器上振荡10秒，室温静置30min。
（6）观察结果，记录出现血凝抑制现象的孔数。
五、实验结果与分析1. 血凝实验通过观察实验结果，发现病毒悬液孔数越多，红细胞凝集现象越明显。
说明病毒具有血凝活性。
2. 血凝抑制实验通过观察实验结果，发现不同浓度的血清孔数出现血凝抑制现象的孔数不同。
说明血清中含有能够抑制血凝的抗体。
六、实验结论1. 血凝实验结果表明，病毒具有血凝活性。
血凝抑制实验报告10篇
血凝抑制实验报告10篇血凝抑制实验报告11 阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。
（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101 kPa,20min高压灭菌，4℃保存备用,保存期1个月）。
2 10%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL 阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。
2.2 洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经1500～1800 r/min 离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。
2.3 10%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。
（此步可省略，直接配制1%红细胞）2.4 1%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mL生理盐水，混合均匀即可。
（根据检测血清的数量，估算一下需要的1%鸡红细胞量，可按0.3ml/每份血清）3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入25μl PBS（生理盐水），换滴头。
3.2吸取25μl抗原加入第l孔，混匀。
3.3从第1孔吸取25μl，病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μl加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25μl 弃之，换滴头。
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)
B
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2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡， 可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与 阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。 2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃 上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分 钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过 程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过 5天。 2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离 心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管 中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红 细胞混合均匀。 2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mLPBS， 混合均匀即可。
血凝和血凝抑制实验
一、重要性
01 有效预防动物疫情的发生 02 有效判断动物疫情发生的原因 03 有效推动动物免疫程序的制定
二、检测内容和方法
检测内容
猪
猪瘟 O型口蹄疫 A型口蹄疫 地方病：蓝耳、细 小、圆环、伪狂犬、 乙脑
羊
O型口蹄疫 小反刍兽疫
牛
O型口蹄疫 A型口蹄疫
鸡
禽流感 新城疫
用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体和滴 定该特异性抗体的水平。
血凝试验：某种病毒的血凝素， 能使鸡、鹅或人的红细胞发生凝 集，叫做血凝试验，也称直接血 凝反应，利用这种特性设计的试 验称血凝试验 (HA) 。
常见于正粘病毒、副粘病毒和某 些黄病毒、痘病毒等。
目的：测定病毒的血凝效价，采用 一定的病毒量，通常采用4个血凝 单位
2.采血完毕后将血加入至10ml离心管中，加3-4倍体积生理盐水以 2000~3000r/min，5~10min离心3-5次。
3.弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液， 上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心 弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。
阿氏（Alsevers）液配制
称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散 热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌， 4℃保存备用。
1%红细胞的配制：
1.为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好 选择采取3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。（抗凝剂与 血液比例为1:4）
血凝试验（HA)原理：
血凝抑制试验（HI）原理
实验病毒血凝和血凝抑制试验课件
• 与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。 在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷 酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带 正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为 8.0~8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带负电荷，向正极移动。
• 用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥 分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的 。
(五) 4单位病毒液的配制
以出现红细胞凝集现象的最高稀释度为 1个单位,将原病毒液稀释成4倍于最高稀释 度的病毒液,即为4单位病毒液.例如:出现红 细胞凝集现象的最高稀释度是2的9次方(病 毒的血凝效价为2的9次方),那么, 4单位病 毒液就为2的7次方.
(六)病毒的红细胞凝集抑制试验
1、加生理盐水50μl于96孔板的一排的1-12孔。
采集新鲜的抗凝血,以生ຫໍສະໝຸດ 盐水洗3次,每次离心 5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成1%浓 度.
(四)红细胞凝集试验
1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12孔 。
2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准病 毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比 稀释至第11孔，弃去50μl，12孔为阴性对照。
• 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA） 。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧 光产率也相对较低。
• 有一些低毒产品替代：sybr green、sybr gold、gene finder
电泳准备
• 用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。 • 用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g
DNA电泳
• 取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液（甘油， 溴酚蓝，DNA稳定剂）混合后，用微量取样器 慢慢将混合物加至样品孔中。
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实验报告
实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题 某一病毒能够引致血凝，是否可以判定它是何种 病毒？如果不行，应该再要进行什么实验？为什么？ 下次实验
血清学试验（凝聚试验和ELISA)p163,171
4 红细胞的解脱现象 某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨 酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下 来，因此，血凝试验的时间太长，可能会 在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实 验过程中必须控制好时间。
三 实验操作
(一)病毒的鸡胚接种与培养 (二)病毒尿囊液的收集 37度培养72小时的鸡胚--放置于4度冰箱,致 死鸡胚--消毒气室--用镊子打开气室-打开壳膜--用 移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升离心管--5000 转,离心5分钟,以去除细胞沉淀--上清液供血凝 和 血凝抑制试验作用. (三)制备1%浓度的鸡红细胞 采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗3次,每次离 心5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成 1%浓度.
二
实验原理
1:红细胞凝集 某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹 病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些 动物的红细胞表面的相应受体结合，从而呈 现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是 配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相 应抗体作用的凝集反应。 这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的
2:红细胞凝集抑制 当病毒被相应抗体中和后，则丧失了凝集红 细胞的功能，即病毒的红细胞凝集特性被抑 制。 3:利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验 鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也 可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制 试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫 效果，或动物是否受到病毒感染 血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验
(六)病毒的红细胞凝集抑制试验 1、加生理盐水50μl于96孔板的一排的1-12孔。 2、加标准血清50μl于一排第一孔，倍比稀释到第11孔， 弃50μl。 3、将50μl病毒的4个血凝单位抗原加至1到第11孔。 4 、然后加 50μl 的 1%鸡红细胞至各孔，混匀，室温静置 30min 。 5、观察结果，确定血清的HI效价。血凝被抑制的抗体最 高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（HI效价）。
载样缓冲液
其中含有的甘油可以使待电泳样品沉在 点样孔底部，避免样品漂浮 其中含有的溴酚蓝（某些还含有二甲苯 青）可以作为电泳速度度的指示分子， 溴酚蓝的迁移位置大约相当于200 bp左 右的线性DNA分子的迁移位置。
溴化乙锭
溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个 三环平面基团。它与DNA的结合无特异性。当染料分 子插入后，导致与DNA结合的染料呈现荧光，DNA吸 收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染 料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下 ，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处发射出 来。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA ）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其 荧光产率也相对较低。 有一些低毒产品替代：sybr green、sybr gold、gene finder
质粒DNA
3条带不是超螺旋、线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA， 其实这三条带以电泳速度的快慢而排序， 分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没 有复制完全的两个质粒连在了一起）。
病毒的血凝和血凝抑制
一 实验目的 1:学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集 2: 掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本 操作 3 ：理解病毒血凝和血凝抑制试验的应用
DNA电泳
பைடு நூலகம்
取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液（甘油， 溴酚蓝，DNA稳定剂）混合后，用微量取样器慢 慢将混合物加至样品孔中。 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据DNA的大 小、1kb和3kb左右的指示剂来判断）后，切断电 源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照记录 结果，估测质粒分子量的大小。
电泳准备
用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放臵电泳梳子。 用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1×TAE–buffer)，在微波炉中加热至 琼脂糖溶解。待溶液冷却至60℃，加入适量 Goldview(或溴化乙锭)至微红，混匀。 将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在5-7mm 之间。 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板 移至装有1×TAE–buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳 子，且使缓冲液没过胶面。
(四)红细胞凝集试验
1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12 孔。 2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准 病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍 比稀释至第11孔，弃去50μl，12孔为阴性对照。 3、加50μl的1%鸡红细胞于每一孔，按病毒的低浓度 至高浓度加入。 4、混匀、室温静止30min 。 5、确定红细胞100%凝聚的病毒的最高稀释度，为 HA滴度。
6、血凝效价（HA）的确定
将板直立，首先观察红细胞阴性对照， 应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附 于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即 为血凝效价。
(五) 4单位病毒液的配制
以出现红细胞凝集现象的最高稀释 度为1个单位,将原病毒液稀释成4倍于最高 稀释度的病毒液,即为4单位病毒液.例如: 出现红细胞凝集现象的最高稀释度是2的9 次方(病毒的血凝效价为2的9次方),那么, 4单位病毒液就为2的7次方.
实验九 质粒电泳 病毒的血凝和血凝抑制
原理
与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。 在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷 酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带 正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为 8.0~8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带负电荷，向正极移动。 用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥 分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的 。