生化与分子生物学实验指导

生化与分子生物学实验指导-（)

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实验一 氨基酸纸层析法

一、实验目的

通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。

二、实验原理

纸层析法(ｐａp ｅｒ c ｈro ｍａt ｏgr ａphy ）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法又称纸色谱法,是用滤纸为支持物,所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成,滤纸纤维与水的亲和力强,与有机溶剂的亲和力弱,因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相,有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的,称上行法；由上向下移动的,称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点),进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf 值表示：

在一定条件下某

种物质的Ｒf 值是常数。Ｒf 值

的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成）不变,Rf 值是常数,故可根据Ｒf 值作定性判断。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的R ｆ值相同或相近,此时如只用一种溶剂展层,就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度,再用另一溶剂展层,从而达到分离目的,这种方法称为双向纸层析法。氨基酸无色,可利用茚三酮显色反应,将氨基酸层析点显色作定性、定量用。所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生(亮)黄色物质。

三、药品器材

1器材

层析滤纸（新华1号)、喷雾器、剪刀、层析缸、毛细管、电吹风、刻度尺、铅笔。

R ｆ

=

原点到层析斑点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离

2试剂

(1)氨基酸溶液:赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液(各组分浓度0．5％)。

(2)展层剂：

V[正丁醇（A．R.)］:Ｖ(80%甲酸):V（水）=15:3:2

(3)显色剂:

0．5g茚三酮溶于１00ｍＬ无水丙酮,贮存于棕色瓶中备用。

四、实验方法

1.滤纸准备:选用新华1号滤纸，裁成5cm×2０cｍ的长方形,在距纸一端２cm处用铅笔轻轻划一基线,在线上每隔１cm作一记号，标出4个原点。

2.点样：用毛细管将氨基酸样品分别点于原点（用量10~20uＬ），用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复2～3次,点子直径不能超过３mｍ。

3.展层:将点好样的滤纸放入装有展层剂的展层缸内盖展层缸进行展层，展层剂液面不能淹没原点基线,当溶剂上升至１5~20cm时,取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿线,把滤纸烘干。

4.显色:用喷雾器在滤纸上均匀喷上显色剂，用热风吹干，层析斑点即可显现。

5.结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状,并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离,计算各色斑的Rf 值，与标准氨基酸的Ｒf 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。

五、实验结果及分析

六、思考题

影响氨基酸Ｒf值的因素有哪些?

实验二甲醛滴定法测定氨基氮

一、实验目的

初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。

二、实验原理

氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：

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－NＨ3是弱酸,完全解离时PH为１１-12或更高,若用碱滴定－NH3所释放的Ｈ＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10,很难准确指示滴定终点。

常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合,生成羟甲基化合物,使上述平衡右移,促使－NＨ3释放H+，使溶液的酸度增加,滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH９．0左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。

如样品为一种已知的氨基酸,从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液,则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度,随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时,表明水解作用已完全。

三、器材及试剂

1.实验器材

25ml锥形瓶;3mｌ微量滴定管;吸管；研钵。

2．实验试剂

(１)3０0ml 0.05moｌ/Ｌ标准甘氨酸溶液

准确称取３75mg 甘氨酸,溶解后定容至100ｍl。

（2)５00ml 0．02mｏl/L标准氢氧化钠溶液

(3)20mｌ酚酞指示剂

0.5％酚酞的5０％乙醇溶液。

(４）400ml中性甲醛溶液

在50ｍl３6－３７％分析纯甲醛溶液中加入１mｌ０.5%酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L 的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。

四、实验方法

1、取３个２5 ml的锥形瓶，编号。向１、2号瓶内各加入0.０5mol/L标准甘氨酸溶液2mｌ和水5ml，混匀。向３号瓶内加入7 ml水。然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂,混匀后各加2 ｍｌ甲醛溶液再混匀，分别用0．0２mｏｌ/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。

重复以上实验两次,记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值,计算甘氨酸氨基氮的回收率。

2、取未知浓度的甘氨酸溶液2ml,依上述方法进行测定,平行做几份,取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。

五、结果处理

1.回收率计算：

甘氨酸氨基氮回收率%= 实际测得量

×100 加入理论量

公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度,再乘以14.008。

2.氨基氮计算:

氨基氮（毫克/毫升)= （V未－V对）×ＮNａOH×14．008

2

公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。Ｖ对为滴定对照液(3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NＮａOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。