实验 LB培养基制备及大肠杆菌的接种
(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌表达操作规程
大肠杆菌表达操作规程大肠杆菌表达操作规程一、实验材料和仪器准备1. 大肠杆菌菌株：选择适合表达目标蛋白的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。
2. 表达载体：选择适合目标蛋白表达的载体，如pET 系列、pBAD系列等。
3. 目标蛋白基因：基因可以通过PCR扩增获得，或者从其他载体中克隆。
4. 培养基：溶液制备LB培养基，配制好含有适当抗生素的LB琼脂板，另外还需要制备适用于大肠杆菌表达的诱导培养基，如TB、SB等。
5. 抗生素：根据载体的需要，选用适当浓度的抗生素。
二、诱导表达实验操作流程1. 预先培养：取一株原始菌落接种到含有适当抗生素的LB液体培养基中，为了避免突变株的污染，建议每次都从冷冻保存的单一菌落开始。
培养条件为37℃，180rpm，过夜培养。
2. 选取合适菌液接种量：从过夜的预培养液中取2ml，用于接种适当量的诱导培养基。
3. 诱导表达：根据所用的表达载体，将接种量转移到含有适当抗生素的诱导培养基中，继续培养。
4. 培养条件：培养条件根据所选表达载体的要求进行设置，一般为37℃，180rpm。
5. 收集细胞：在适当的时间点，如在菌液浓度达到指定值或培养时间达到一定程度后，通过离心收集细胞。
6. 细胞破碎：采用适当的方法破碎细胞膜，如超声波破碎、冻融法等。
7. 蛋白质提取：以适当的缓冲液提取目标蛋白质。
8. 蛋白质纯化：采用各种纯化方法（如亲和层析法、凝胶过滤法等）对蛋白质进行纯化。
9. 检测和分析：对蛋白质进行SDS-PAGE、Western blot等分析方法进行检测。
三、注意事项1. 培养条件的控制：控制好培养温度、转速和时间等条件，以保证表达的效果。
2. 抗生素浓度的选择：根据所用载体对抗生素的要求，选择适当的浓度以抑制非目标菌株的生长。
3. 提取和纯化条件的选择：选择适当的缓冲液、酶和抑制剂，以保持目标蛋白的活性和稳定性。
4. 实验材料的无菌处理：所有实验材料（包括培养基、平板、显微镜片等）都要经过严格的无菌处理，以防止外源性污染。
大肠杆菌培养
大肠杆菌培养引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性细菌。
它是一种常见的微生物实验室模型生物，在分子生物学研究、基因工程、生物技术等领域发挥着重要作用。
本文将介绍大肠杆菌的培养方法，包括培养基的配制、接种方法、培养条件的控制等。
培养基配制大肠杆菌培养基的配制是培养大肠杆菌的重要前提，不同的菌株和研究目的需要使用不同的培养基。
下面介绍两种常用的培养基配方：Luria-Bertani（LB）培养基LB培养基是最常用的大肠杆菌培养基之一，它是一种富含营养物质的培养基，适用于一般的大肠杆菌培养。
配方：•水：800 ml•Bacto-tryptone：10 g•Yeast extract：5 g•NaCl：10 g•琼脂：15 g将上述成分加入水中，搅拌均匀，然后加热至溶解，最后将pH调节至7.0 ± 0.2。
M9盐基培养基M9盐基培养基是一种缺乏有机碳源和氮源的无营养培养基，适用于研究大肠杆菌的生理特性或用于表达外源蛋白。
配方：•水：700 ml•Na2HPO4：12.8 g•KH2PO4：3 g•NH4Cl：1 g•NaCl：0.5 g•CaCl2：0.1 g•MgSO4：0.2 g•葡萄糖：2 g•琼脂：15 g将上述成分加入水中，搅拌均匀，然后加热至溶解，最后将pH调节至7.0 ± 0.2。
接种方法大肠杆菌的接种方法有多种，常见的有无菌接种环和无菌注射器接种法。
下面分别介绍这两种接种方法：无菌接种环接种法步骤：1.用火焰将无菌接种环烧红，冷却至适宜温度。
2.打开培养基瓶盖，用无菌接种环蘸取待接种的大肠杆菌菌株。
3.快速将无菌接种环插入含有培养基的琼脂平板（或试管）中，并迅速转动接种环1-2圈，使菌体均匀分布在琼脂平板（或液体培养基）表面。
4.关闭琼脂平板（或试管）盖子，使琼脂凝固后，将琼脂平板（或试管）置于适宜的培养条件下。
无菌注射器接种法步骤：1.用火焰将无菌注射器的针头烧红，冷却至适宜温度。
大肠杆菌检测实验报告
一、实验目的1. 掌握大肠杆菌检测的基本原理和方法；2. 学会使用国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数；3. 提高微生物实验操作技能，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是一种革兰氏阴性菌，广泛存在于人类和动物肠道中，属于条件致病菌。
本实验采用国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数，主要利用大肠杆菌在LB培养基上生长繁殖的特性，通过计数菌落数来估算大肠杆菌的浓度。
三、实验器材1. 培养箱；2. 移液管（10只）；3. 锥形瓶（250ml，12只）；4. 大试管（5只）；5. 试管架；6. 平皿（45个）；7. 大烧杯（500ml，1个）；8. 电子天平；9. 纱布；10. 脱脂棉；11. 灭菌锅；12. pH计或pH试纸；13. 电炉；14. 石棉网；15. 铁架台；16. 量筒（100ml，1个）；17. 橡皮手套；18. 超净台。
四、实验药品1. 磷酸盐缓冲液；2. 蒸馏水；3. LB培养基；4. 琼脂；5. 5%NaOH；6. 5%HCl。
五、实验步骤1. 培养基制备（1）称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中；（2）用量筒量取125ml的蒸馏水加入锥形瓶中，制成培养基；（3）用棉花堵住锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢；（4）将培养基放入灭菌锅中，在121摄氏度下灭菌20min；（5）灭菌后放入超净台中备用。
2. 样本处理（1）取适量样本（如食品、水等）；（2）用无菌生理盐水进行梯度稀释；（3）取适量稀释液加入平皿中，制成平板；（4）将平板放入培养箱中，在37摄氏度下培养24h。
3. 菌落计数（1）观察平板，找出菌落数在30-300之间的平板；（2）用移液管吸取适量菌液，加入锥形瓶中；（3）在锥形瓶中加入适量的5%NaOH溶液，充分振荡；（4）将锥形瓶放入培养箱中，在37摄氏度下培养24h；（5）观察锥形瓶中的菌落生长情况，记录菌落数。
大肠杆菌灭活苗的制备实验报告
大肠杆菌灭活苗的制备实验报告实验目的：1.熟悉大肠杆菌培养和灭活方法；2.学习掌握灭活苗制备的实验技术。
实验原理：实验步骤：1. 大肠杆菌培养：取一块LB平板，用灭菌铁环沾取一点大肠杆菌单克隆菌株，点接在含有LB培养基的离心管中。
将培养管放入恒温摇床中，以37℃、200rpm的条件下培养12-16小时。
2.培养基的制备：将1LLB培养基溶解于适量的蒸馏水中，加入适量的琼脂糖。
将混合溶液调节至pH7.0左右，然后将溶液加热至溶解琼脂糖完全。
将溶液分装入离心管中，每管倒满2/3，然后将倒置固化。
3.灭活实验：将大肠杆菌培养物离心，去除上清液，然后加入对应的化学灭活剂。
常用的化学灭活剂有福尔马林、甲醛以及石灰。
选择合适的灭活剂和浓度，将大肠杆菌悬液与灭活剂混合，混匀后放置室温下静置一段时间。
4.灭活后的处理：灭活结束后，将灭活后的大肠杆菌培养物通过离心使菌体沉淀，去除上清液。
然后用生理盐水洗涤培养物，再次离心使菌体沉淀。
重复洗涤步骤，以去除残留的灭活剂。
5.疫苗的制备：将洗涤后的菌体沉淀用生理盐水稀释至适宜浓度，然后将稀释液分装入疫苗瓶中。
6.储存条件：将制备好的大肠杆菌灭活苗储存在2-8℃的冰箱内。
储存期一般不超过3个月。
实验结果：制备好的大肠杆菌灭活苗应该呈现透明无菌液体。
实验注意事项：1.在培养大肠杆菌时要注意无菌操作，避免外源菌污染。
2.在灭活过程中，要控制好灭活剂的浓度和作用时间，避免对菌体产生过大的损伤。
3.制备疫苗后要储存于低温冰箱中，避免菌体的破坏和变化。
4.实验过程中要注意个人防护，避免与化学灭活剂直接接触。
实验总结：通过本次实验，我们成功地制备了大肠杆菌灭活苗。
制备疫苗的过程需要准确掌握各个步骤和相关技术，以确保疫苗的质量和效果。
此外，实验中还需要注意无菌操作、化学灭活剂的使用和个人防护等安全问题。
通过这次实验，我们不仅熟悉了大肠杆菌的培养和灭活方法，还对灭活疫苗的制备过程有了更深入的了解。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入 1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入 2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨10.0g酵母粉 5.0g氯化钠10.0g水1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌的培养
大肠杆菌的培养1. 介绍大肠杆菌(Escherichia coli)是一类具有多种生物学功能的革兰氏阴性菌，在科学研究和工业生产中广泛应用。
为了更好地利用大肠杆菌及其功能，需要对其进行培养和分离，以获得足够的生物材料。
2. 大肠杆菌培养的基本方法大肠杆菌的培养需要特定的培养基和条件。
下面介绍大肠杆菌的基本培养方法。
2.1 培养基的选择常用的大肠杆菌培养基包括Luria-Bertani(LB)培养基、MacConkey培养基和TB培养基等。
其中，LB培养基为较为广泛应用的培养基。
其主要组成成分包括营养成分、糖类、盐类等。
在实验室中，通常用LB培养基作为大肠杆菌的培养基。
2.2 培养条件的控制大肠杆菌的生长适宜温度为37℃，PH值为7.2-7.5，培养过程中需要适宜的氧气供应。
在LB培养基中培养时，可以在室温下保存，但最好在4℃下保存。
2.3 常见实验的流程在实验中，通常需要进行以下操作：菌的接种、培养、收获和保存等。
1.菌的接种首先需要选择一个新鲜的培养基，将大肠杆菌的菌种接种到培养基上。
通常使用无菌的卡片棒进行操作，经过操作后菌种应均匀分布在培养基表面。
2.培养接下来将接种好的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下进行培养。
培养期间需要观察培养基的状态，如果出现不规律的杂质，则需要重新接种。
3.收获当菌种生长到一定程度后，可以进行收获。
收获的方法主要有离心沉淀和过滤两种。
其中离心沉淀可以采用低速离心和高速离心排液的方法，而过滤通常采用滤纸或滤膜的方法进行。
4.保存最后需要将采集到的菌液进行保存。
保存可采用冷冻或冻干的方法，分别可以在-20℃和-80℃下保存。
3.大肠杆菌的培养可以通过合适的培养基和条件，使其生长和繁殖。
根据实验的具体需要，可以选择相应的培养基和培养方法，以保障实验的有效性和准确性。
lb培养基实验原理
lb培养基实验原理
实验原理：LB培养基（Luria-Bertani medium）是一种常用的培养基，用于培养和繁殖大肠杆菌等细菌。
该培养基含有适宜的营养成分，能够提供大肠杆菌生长所需的能量和营养物质。
LB培养基主要由三个基本成分组成：氨基酸、糖类和盐类。
氨基酸提供大肠杆菌合成蛋白质所需的氮源和碳源；糖类（通常是葡萄糖）提供能量和碳源；盐类则提供了其他微量元素和离子。
在实验中，LB培养基常以固体形式使用，即将LB培养基与琼脂混合并冷却凝固，形成LB琼脂平皿。
将经过消毒处理的LB琼脂平皿用无菌的棉签沾取待测菌种，均匀涂布在琼脂表面上。
然后将涂布好的平皿反转，置于37摄氏度的培养箱中进行孵育。
在培养箱中，大肠杆菌会通过分裂繁殖，在LB培养基上形成细菌克隆。
由于LB培养基富含营养物质，适宜的温度和湿度条件，大肠杆菌能够快速生长并形成克隆菌落。
通过观察和计数菌落，可以推测原始培养物中所含的细菌数量，并判断是否存在特定性状的菌落。
实验原理中不包含标题相同的文字，通过使用LB培养基来培养大肠杆菌的方法和原理已经说明清楚。
分子操作基本技术实验报告LB培养基的配制和大肠杆菌的培养
实验一LB培养基的配制和大肠杆菌的培养第一部分理论知识一．生物工程所需的微生物学原理基因工程主要采用革兰氏阴性细菌作为宿主细胞表达系统。
下面着重讲述大肠杆菌。
1.大肠杆菌的一般特性大肠杆菌（Escherichia coli，简写为E.coli）属于革兰氏阴性细菌，大肠杆菌不仅能液体培养，也能在固体培养基上很好地生长。
在细菌培养过程中，有两方面的因素影响它的纯度：1.其它细菌造成的细菌污染。
因此，用于培养的所有药品、器皿必须消毒，全部过程应在无菌条件下操作；2.遗传的异质性。
遗传上的异质性发生在培养过程中原有细菌株系遗传成分的变异，导致原有标记性状的改变。
其原因可能是天然突变的结果；或是在由质粒携带标记性状的情况下，异质性可能来自细胞分裂过程中质粒的丢失或质粒的分离。
据目前所知，许多质粒以相当高的频率在寄主细胞分裂时发生分离，从而引起所带性状的变化。
2. 抗生素抗性抗生素阻止细菌生长往往有抑菌和杀菌两种方式。
抑菌就是指药物仅仅使细菌生长受阻而未直接引起细胞死亡；而杀菌是指药物引起细胞裂解或死亡。
一种抗生素抑菌或杀菌效果取决于细菌接触药物的条件。
例如，大肠杆菌接触低水平的四环素将会通过四环素与核糖体结合，影响细菌蛋白质的合成而最终抑制细胞生长。
然而，结合着四环素的核糖体是可恢复的，因为受抑制的细胞被稀释到无药物的培养基上，将会重新恢复正常细胞的生长。
这种抑制的可恢复性表明四环素正以抑菌的方式发挥功能。
当四环素浓度加大，阻止细菌声中的另一种方式变得明显而不可逆，亦即在高浓度下，四环素以杀菌方式发挥功能。
细菌有三种抗生素抗性的机制：（1）抗生素在细菌中作用的目标位置发生了变化。
例如蛋白质合成抑制剂链霉素的抗性通常是由于细菌合成了一种变化了的核糖体蛋白质，这种蛋白质不再与链霉素相连，因此阻止了链霉素的抑制行为；（2）组织药物进入细胞。
如对四环素的抗性是由于细菌合成了阻止四环素进入细胞的膜蛋白，因而四环素的穿透性大为减低所致；（3）改变或钝化药物。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
.大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备o C冻存。
-80 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
实验九 LB琼脂平板培养大肠杆菌
实验九LB琼脂平板培养转化的大肠杆菌一、实验目的1、学会LB琼脂平板的制备。
2、掌握筛选阳性转化产物的方法。
二、实验原理LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。
加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
载体上携带有抗氨苄青霉素（Amp）的标记基因，目的DNA和大肠杆菌自身都没有抗Amp的基因。
将目的DNA与载体连接后，转化至大肠杆菌上，再将转化产物涂抹在含有Amp的LB培养基上培养，可以大量繁殖（克隆）目的DNA片段。
三、实验仪器及药品耗材1、主要仪器：超纯水仪、电子天平、水浴锅、灭菌锅、移液器、超净工作台，恒温培养箱等。
2、主要药品及耗材：50 mg/ml 氨苄青霉素、蛋白胨、酵母、琼脂粉、Nacl、转化后复苏的菌液、无水乙醇、一次性手套、移液器吸头、塑料封口膜、美国进口封口胶、称量纸、烧杯、培养皿、涂布棒、剪刀等。
四、实验步骤1、LB培养基制备（100 ml）：胰化蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，Nacl 1 g，琼脂粉1.4 g，加蒸馏水定容至100 ml，将培养基溶解后于121℃灭菌25分钟。
在超净工作台内，待培养基冷却到一定程度，加入100ul 50 mg/ml 氨苄青霉素（Amp），混匀后倒入培养皿，至LB培养基冷却凝固。
2、涂菌：将转化后复苏的菌液3500 rpm 离心3 min，去500 μl上清液，吸取100 μl菌液到Amp LB 固体培养基上，用无菌的涂布棒将菌液均匀地涂开直至干燥（可以根据培养后菌落的多少适当调整涂板的菌液量）。
3、培养：将涂菌后的LB平板用封口胶密封，倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养12～16个小时。
五、作业记录实验现象。
大肠杆菌实验总结
⼤肠杆菌实验总结分离划线分离：⽅法简单，但单菌落较难分开。
涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
（⼀）制备LB培养基（通⽤的细菌培养基）1、配⽅：蛋⽩胨10.0克，⽜⾁膏5.0g，氯化钠10.0克，⽔1000ml（配固体培养基再加琼脂20克）2、流程计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板培养基配制(特)培养基应现配现⽤，每次配置350ml，⼀次性使⽤完毕。
1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：2、⽤双层铝箔和棉绳对锥形瓶进⾏封⼝，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。
待灭菌。
①分装：注意不要使培养基沾在管⼝或瓶⼝上，因此在将培养基转移到三⾓瓶或试管中时必须⽤___三⾓漏⽃ _。
②加塞：试管⽤塑料盖或__棉花塞___；三⾓瓶⼝⽤_封⼝膜__或_6层纱布封⼝,再⽤__⽜⽪纸__或报纸封⼝。
③包扎：⽤_⽜⽪纸__或报纸④灭菌：⾼压蒸⽓灭菌法 1）加⽔：向外层锅内加⼊适量的⽔，加⽔的要求是不触及内胆 _.2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排⽓软管插⼊内层灭菌桶的_排⽓槽__内。
再以__两两对称⽅式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧⼀致，勿使漏⽓。
3）加热排⽓：打开排⽓阀，使⽔沸腾以排除锅内的冷空⽓。
待冷空⽓完全排尽后，关上排⽓阀。
4）保温保压：当锅内压⼒升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压⼒⾄15 _min。
5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度⾃然下降，当压⼒降⾄_0_时，打开_排⽓阀__，旋松螺栓，打开盖⼦，取出灭菌物品。
否则会因锅内压⼒较⾼，打开⽓阀后造成的压⼒差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基⽽发⽣污染，甚⾄使容器爆炸。
灭菌后，通常将实验⽤具放⼊60℃~80 ℃_烘箱中烘⼲，以除去灭菌时的⽔分，避免引起_污染_。
⑤倒平板、制斜⾯操作平台：超净台灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开__紫外线 _和_过滤风，灭菌30min.倒平板：待培养基冷却⾄__60_ ℃时，将每只培养⽫倒⼊_10~12_ml未凝固的固体培养基，置于_⽔平_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平⽫底部，待凝，使之形成平⾯。
大肠杆菌培养操作规程
大肠杆菌培养操作规程大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性细菌，广泛存在于土壤、水体、动植物体内等环境中，是一种重要的实验菌株。
在分子生物学和遗传工程的研究中，常用大肠杆菌作为宿主进行DNA重组、蛋白表达等操作。
下面是大肠杆菌培养操作规程，详细介绍了培养基配制、无菌操作和培养条件的要点。
一、培养基配制1.LB培养基配制：-将10g/L的蛋白胨和5g/L的酵母粉加入1000mL的蒸馏水中，搅拌溶解。
-加入5g/L的氯化钠和15g/L的琼脂糖，搅拌均匀。
-调节pH值为7.0，并用蒸馏水补足到1L。
-装入适量培养瓶中，用自吸过滤器过滤杂质后，压紧玻璃瓶盖。
-在121°C高压蒸汽灭菌器中高压下蒸煮30分钟。
-冷至50°C左右后，即可使用。
2.青霉素抗生素的添加：- 使用10mL 的β-内酰胺抗生素青霉素钾盐（100mg/mL）。
-在室温下将药物滴入培养基中。
-搅拌使药物均匀分布于培养基中。
二、无菌操作1.无菌操作区域：-使用无菌柜进行操作，以保证培养物中不受到外界的细菌污染。
-操作前将无菌柜的工作区域用75%酒精喷雾消毒。
2.培养物接种操作：-取一支培养物的试管，用无菌匙蘸取培养物碰触到无菌培养基，轻轻搅拌均匀。
-取一支无菌的移液管，将含有培养物的液体尽量缓慢地加入到培养基中。
-在接种完成后，用无菌铝箔封好培养基表面，以防止进一步的细菌污染。
三、培养条件1.温度与时间：-大肠杆菌在常规情况下在37°C下生长最好。
而对于一些特殊要求的实验，也可在30°C或42°C下培养。
-培养时间根据实验不同而定，通常在12-16小时为一个周期。
2.培养环境：-培养过程中应控制氧气的供应量，通常可以使用摇床培养。
-pH值控制在6.8-7.2之间，以便细菌生长繁殖。
3.培养密度：-通常使用100-1000mL培养基装入培养瓶中，以便细菌有足够的空间进行生长。
-在培养过程中需要适时摇晃培养瓶，以帮助培养物进行氧气和营养物的均匀供应。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养基配制及培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛用于分子生物学实验和基因工程研究中。
为了成功培养大肠杆菌，我们需要配制适合其生长繁殖的培养基，并采用正确的培养方法。
以下是大肠杆菌培养基的配制及培养方法的详细介绍。
一、大肠杆菌培养基的配制1. Luria-Bertani（LB）培养基LB培养基是最常用的培养基之一，其成分包括三个主要组成部分：氮源、碳源和盐类。
氮源：用于提供细菌所需的氮元素，可以使用氨基酸、含氮化合物等。
常用的氮源有氨基酸混合物、酵母提取物和酪蛋白水解物等。
碳源：用于提供细菌所需的碳元素，可以使用单糖、复糖、酒精、醇等。
常用的碳源有葡萄糖和乳糖等。
盐类：培养基中加入适量的盐类，以提供维持细菌生长所需的离子平衡，常用的盐类有氯化钠、磷酸二氢钠、氯化镁等。
将氮源、碳源和盐类按照一定比例混合，加入适量的蒸馏水中，调节pH值至7.0左右，然后用高压蒸汽灭菌。
2.M9培养基M9培养基是一种突变细菌筛选培养基，其主要成分是无机盐和碳源。
无机盐：使用硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钠等无机盐调配而成。
碳源：使用葡萄糖、蔗糖、乳糖等单糖或多糖。
按照一定比例混合无机盐和碳源，加入适量的蒸馏水中，调节pH值至7.0左右，然后用高压蒸汽灭菌。
二、大肠杆菌的培养方法1.培养前的预处理将所需的培养基配制好，装入洁净的培养皿或试管中，然后用高压蒸汽灭菌。
在培养大肠杆菌前，需要将冻存的菌株从-80℃的冰箱中取出，快速化解并接种至预先准备的LB或M9培养基中。
2.培养条件大肠杆菌的适宜生长温度为37℃，因此在培养过程中需要将培养皿放在37℃恒温培养箱中。
同时，还需控制培养时间和培养瓶内的氧气含量。
3.培养方法（1）液体培养将培养基加热至适温后，接种所需菌株，一般取两根菌体悬浮液放入新鲜的培养基中，使得初始菌体数约为10^7个/毫升。
随后放入37℃恒温培养箱中培养，每隔一段时间取样进行检测。
大肠杆菌如何培养
大肠杆菌如何培养大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，是常见的肠道菌群中的一种。
大肠杆菌在科研领域和工业领域中非常重要，因为它作为一种模式微生物，广泛应用于基因工程、蛋白表达、酶制备、细胞生物学等领域的研究和应用。
培养大肠杆菌需要一定的培养基和条件，下面将介绍大肠杆菌的培养方法。
一、培养基的准备培养大肠杆菌所需的基本培养基是含有营养物质的培养液，如Luria-Bertani培养基（LB培养基）。
LB培养基的主要成分包括蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和葡萄糖。
可以根据需要对LB培养基进行改良，如添加不同的抗生素以筛选转基因菌株。
二、大肠杆菌的分离和保存1.分离方法：（1）从样品中取一小部分，如土壤样品、水样或其他样品，制备10倍稀释系列。
（2）将每个稀释液均匀地涂布到含有LB培养基的琼脂平板上。
（3）将琼脂平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养约12-24小时，直到出现菌落。
（4）将不同形态的菌落挑选出来，用成层排样法分离出单斑菌株。
2.保存方法：（1）利用冷冻保存：将单斑菌落接种到含有LB培养基和15%甘油的离心管中，混匀后急速冷冻到-80℃，并进行长期保存。
（2）利用冷冻干燥保存：将单斑菌落接种到含有LB培养基的离心管中，培养后在-80℃的环境下进行冷冻干燥。
三、大肠杆菌的液体培养1.悬浮培养：（1）从保存的冷冻物中，挑选适量的菌落接种到含有LB培养基的培养瓶中。
（2）将培养瓶放入37℃恒温摇床中以200-250rpm的振荡速度摇培养约8-12小时。
2.深层培养：（1）取一定量的培养液接种到含有LB培养基的试管中，将试管倾斜放置，使培养液接触空气。
（2）将试管放入37℃恒温培养箱中培养12-24小时，直到培养液产生沉淀。
四、大肠杆菌的固体培养1.斜面培养：（1）将大肠杆菌接种到含有LB培养基的琼脂平板上。
（2）将琼脂平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养约12-24小时，直到出现菌落。
大肠杆菌实验结果与分析
大肠杆菌实验结果与分析大肠杆菌（Escherichia coli）是常见的肠道菌群中的一种细菌，在许多实验室中被用作模式生物来进行研究。
在本篇文章中，我将会对实验结果和分析进行详细描述。
实验目的：本实验的目的是研究大肠杆菌对不同环境条件的生长和生存能力，并分析与这些条件相关的影响因素。
实验材料和方法：1.实验菌种：采用常见的大肠杆菌菌株。
2.实验培养基：采用LB琼脂糖平板培养基。
3.不同环境条件：在不同实验组中设置不同的环境条件，包括：温度、pH值、营养浓度等变量。
4.实验过程：将大肠杆菌接种到LB琼脂糖平板培养基上，按照设定好的条件进行培养，并记录生长情况。
实验结果：根据实验数据，我们得到了以下实验结果：1.温度影响实验：在不同温度条件下培养大肠杆菌，我们观察到以下现象：-在低温条件下（例如4°C），大肠杆菌生长缓慢，呈现抑制状态。
-在适温条件下（例如37°C），大肠杆菌生长繁殖迅速，形成较大的菌落。
-在高温条件下（例如50°C），大肠杆菌生长受到抑制，甚至可能死亡。
2.pH值影响实验：在不同pH值条件下培养大肠杆菌，我们观察到以下现象：-在酸性环境中（pH值低于7），大肠杆菌生长受到一定程度的抑制，菌落变小。
-在碱性环境中（pH值高于7），大肠杆菌生长繁殖迅速，菌落变大。
-在极端酸性或碱性环境中（pH值过低或过高），大肠杆菌生长受到严重抑制甚至死亡。
3.营养浓度影响实验：在不同营养浓度条件下培养大肠杆菌，我们观察到以下现象：-在低营养浓度条件下，大肠杆菌生长缓慢，菌落较小。
-在高营养浓度条件下，大肠杆菌生长迅速，菌落变大。
实验分析：基于以上实验结果1.温度对大肠杆菌的生长有重要影响。
适宜温度范围内，大肠杆菌生长繁殖迅速。
过低或过高温度会对其生长产生不利影响。
这是因为温度影响了大肠杆菌的代谢物质转运速率和酶活性，进而影响它们的生长速度。
2.pH值对大肠杆菌的生长也具有重要影响。
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划线分离具体步骤：
1. 取菌种前灼烧接种环，消灭接种环上的微生物，冷却；
2. 用接种针挑取单菌落，迅速送入培养皿内，培养基的一边 划Z线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不 要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破；
3. 灼烧接种环，待接种环冷却后，转动培养皿约70°角，用 烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次划线；
LB培养基的配方如下： 酵母提取物：5 g 蛋白胨： 10 g NaCl： 10 g 琼脂： 15～20 g 水： 1000 mL pH 7.0
四、实验方法
平板划线分离法 细菌的接种方法有很多种，如划线法、涂布法、倾注法、
斜面接种法、液体培养基接种法、螺旋接种法等。 平板划线分离接种环冷却后，用同样方法，通过第二次 划线部分作第三次划线和通过第三次划线部分作第四次划 线；
5. 划线完毕后，盖上皿盖，以封口条将培养皿封好，标注日 期；
6. 灼烧接种环； 7. 培养皿倒置于恒温箱培养。
灼烧接种环 灼烧接种环 灼烧接种环 灼烧接种环 灼烧接种环
五区 四区
冷却
培养基灭菌
五、实验步骤
LB液体培养基、LB固体培养基、培养皿高压灭 菌。
制作平板 扩大培养 划线分离
菌种保存
超净工作台中，将灭菌后冷却到60℃左右的LB 固体培养基倒入灭菌培养皿中，敞盖冷却，备 用。
将大肠杆菌接种到LB液体培养基中，于37℃摇 床中震荡培养12h。
以接种环取震荡培养后的菌液，在固体培养基 上划线，封口。培养皿倒置与37℃的恒温培养 箱中培养12~24h，观察划线末端的菌落生长情 况；用接种环挑取单菌落，用划线法接种于斜 面上，在37℃的恒温培养箱中培养24h。
冷却
冷却 冷却
冷却 一区 二区 三区
挑单菌落
划线 （第一区域）
划线 （第二区域）
划线 （第三区域）
划线 （第四区域）
划线 （第五区域）
灼烧接种环
平板倒置培养
六、实验结果
次日观察有无单菌落出现，拍照。
八、思考题
1. 为什么第一次划线前要灼烧接种针？为什么其他每次划 线之前都要灼烧接种针？
2. 在灼烧接种针之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 3. 在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种针吗？为什么？ 4. 为什么每次划线操作总是从上一次划线的末端开始？
实验二 LB培养基制备及 大肠杆菌的接种
一、 实验目的
了解LB培养基的配制方法； 掌握平板划线分离法的操作方法； 培养无菌观念，巩固无菌操作技术。
二.、实验原理
平板划线分离法：是指把混杂在一起的微生物或同一微 生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过 分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养 后生长繁殖成单菌落。
1、大肠杆（Escherichia coli ）
特点：DH5α是一种经 诱变的菌株；缺乏DNA 修饰，即其自身DNA不会 被修饰；缺乏“免疫”机 制，不会对导入的外源 DNA进行切割；对青霉素 敏感。 用途：基因工程受体菌。
2、LB培养基
是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌 等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入 抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作， 将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划 线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子 细胞群体。
三.、实验器材
菌种：大肠杆菌 DH5ɑ 培养基：LB固体培养基 仪器材料：超净工作台，接种针，酒精灯，封口 条，
记号笔，恒温培养箱。