原生质体融合技术

原生质体融合技术的局限性

植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。

植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。

原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。

1.技术局限性

植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。

1.1诱导原生质体融合

诱导原生质体融合是体细胞杂交的最基本的技术环节。融合方法的选择受到很多实验条件的限制。常用的化学方法有化学方法与电融合方法。化学方法中用的最多的是聚已二醇（PEG）融合技术。但是这种方法中PEG与高PH强加于原生质体的非常生理条件，PEG 的相对分子质量、纯度、浓度、处理时间、原生质体的状况和密度等都会影响PEG融合技术，而且其融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用；而影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。

而且对于不同的植物材料需要经过多次实验，才能找出这些参数的适当值。这就制约了原生质体融合技术成为常规育种方法。

1.2杂种细胞的选择

为了将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，一般有以下选择方法：

1.2.1利用或诱导各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来；

互补选择一般要求有相应的突变体。在体细胞杂交的研究中，虽然人们已经建立和利用了各种各样的突变体，但是在植物中要建立突变细胞系比较困难，如果要使突变细胞系保持再生能力就更难了，因此在实际应用中受到很大的限制。

1.2.2机械选择法

利用荧光素标记分离杂种细胞取得了一定的成效，但是显微镜操作费工费时，选择出异

核体的量很少，而且获得的杂种细胞必须进行单细胞培养，所用实验材料的原生质体必须具有单细胞培养再生植株的能力，因此这种方法具有一定的局限性，要获得大量的杂种植株比较困难；应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞，但是由于仪器比较昂贵，目前采用的人还是不多。

1.2.3组织培养筛选法

人为地造成细胞生长或分化能力的差异进行选择。

但是这三种方法的利用都有一定的局限性，应视不同的情况选择使用。

2.理论局限性

体细胞杂交与有性杂交不一样，除了涉及双亲的细胞核外，还涉及了双亲的细胞质。它不仅可以使双亲的细胞核发生基因重组，还可以使双亲的细胞质中的叶绿体基因组和线粒体基因组重新组合。还可以为遗传育种提供新的材料和资源，但同时又带来了较为复杂的关系。应用体细胞杂交技术可以克服部分远缘组合间的不亲和，但尚不能从根本上解决此问题，虽然可以诱导任何两个物种间的原生质体融合，然而，目前获得的体细胞杂种植株仍限于少数物种。

另外，由于难以控制供体和受体基因组有丝分裂和减数分裂中的重组行为，因此，转移期望基因和形状的概率较小。这是限制目前体细胞杂交技术在育种实践中应用的一个主要障碍。在基因重组过程中还有可能整合一些不需要的基因或缺失一些有益基因，从而造成所获得的杂种材料产生较大的遗传变异而难以应用于育种实践。体细胞杂交在改良作物的育种实践中曾经对它的应用潜力估计过高，实践证明并非像人们想象的那么简单，要获得期望的体细胞杂种植物难度仍然较大。

体细胞杂种难以应用于育种实践中的另一个问题是大多数种间体细胞杂种不育，或育性较低，或花粉活力较低。除了那些无性繁殖作物之外，不育的体细胞杂种植株很难应用到育种实践中，以为一般体细胞杂种植物是通过回交的办法来逐渐减少供体基因的成分，保留所期望的基因或形状，从而达到改良作物的目的。体细胞杂交作为一种育种途径，还必须与常规育种技术相结合，才能作为作物遗传改良作出更大的贡献。