新教材高中生物第3章基因工程 基因工程的基本工具与聚合酶链式反应PCR技术教师用书苏教版选择性必修3

第一节基因工程及其技术第1课时基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术课标内容要求核心素养对接1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。

2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。

生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。

科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。

社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。

一、基因工程是在多学科基础上发展而来的1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。

↓1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。

↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。

史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。

↓1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。

↓1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。

↓接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。

↓1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。

↓1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。

二、基因工程的基本工具1．基因工程(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。

(2)原理：基因重组。

(3)操作水平：基因(分子)水平。

2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列,并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

(2)特点：特异性(专一性)很强。

(3)切割方式①错位切：在DNA分子两条链的不同部位进行切割,切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的单链,称为黏性末端。

②平切：在DNA分子两条链上相同的部位进行切割,切割后形成平末端。

3．“分子黏合剂”——DNA连接酶(1)作用：连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键。

(2)类型①E.coli DNA连接酶：分离自大肠杆菌,可以连接黏性末端的DNA分子。

②T4 DNA连接酶：分离自T4噬菌体,可以连接黏性末端或平末端的DNA分子。

4．“分子搬运工”——载体(1)作用：将外源基因导入受体细胞,并使其在受体细胞中稳定遗传和表达。

(2)类型：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。

(3)组成：复制原点、适合的标记基因、多种限制酶的切割位点。

(4)改造：基因工程上用作载体的质粒一般都是经过人工改造过的。

三、聚合酶链式反应(PCR)技术1．PCR概念：目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。

2．原理：类似于DNA的复制。

3．条件①模板DNA：DNA的两条链。

②引物对：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。

③原料：4种dNTP。

④热稳定的DNA聚合酶：Taq酶。

⑤其他：缓冲液、Mg2＋等。

4．过程(1)变性：在约94_℃高温下,作为模板的双链DNA解旋(变性)为两条单链DNA。

(2)退火：反应体系的温度降至约55 ℃,2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。

(3)延伸：反应体系的温度回升到约72_℃左右,4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则,在Taq酶的作用下连接到引物的3′端之后,使引物链延伸,并形成互补的DNA双链。

判断对错(正确的打“√”,错误的打“×”)1．基因工程的原理是基因重组,不过在这里这种变异是定向的。

( ) [答案] √2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。

( ) ×提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体,没有DNA聚合酶。

3．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。

( ) [答案] √4．DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端。

( ) ×提示：E.coli DNA连接酶不能连接平末端。

5．载体的种类有质粒、噬菌体、动物病毒等,其中动物病毒必须是DNA病毒。

( )[答案] √6．PCR技术需要热稳定的DNA聚合酶和解旋酶的参与。

( ) ×提示：PCR技术中通过加热使双链DNA解旋,不需要解旋酶参与。

7．扩增目的基因时只需要一种引物。

( )× 提示：需两种引物分别与两条母链结合。

基因工程的工具酶1．限制性内切核酸酶(1)作用特点：具有专一性,表现在以下两个方面①能够识别双链DNA 分子中特定的核苷酸序列。

②能够切割特定序列中的特定位点。

(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则,无论是奇数个碱基还是偶数个碱基,都可以找到一条中心轴线,如图,中轴线两侧的双链DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。

如GCCG ⎪⎪⎪GC CG 以中心线为轴,两侧碱基互补对称；以为轴,两侧碱基互补对称。

(3)作用产物：黏性末端或平末端。

①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时形成的,如图所示：②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的,如图所示：2．限制性内切核酸酶与DNA 连接酶的关系(1)区别作用 应用 限制性内切核酸酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体DNA 连接酶 在DNA 片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质相同,都是催化磷酸二酯键的形成不同点是否需要模板不需要需要接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上,形成磷酸二酯键作用结果将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子用途基因工程DNA复制合作探究：(1)为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵,原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA 而保护自身。

原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子,因为酶具有专一性或自己的DNA 分子已被修饰而不被识别。

(2)限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开,体现了酶的专一性。

E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来,对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端,又可以连接双链DNA分子的平末端,都对末端的碱基序列没有要求,因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。

1.限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示,下列有关说法正确的是( )A．一个DNA分子中,酶a与酶b的识别序列可能有多个B．酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接C．酶a与酶b切断的化学键不完全相同D．用酶a切割有3个识别位点的质粒,得到4种切割产物A[一个DNA分子中,可能存在一个至多个酶a与酶b的识别序列,A正确；由图可知,酶a与酶b识别的序列虽然不同,但切出的黏性末端相同,相同的黏性末端能相互连接,B错误；酶a与酶b切断的化学键均为相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,C错误；质粒为小型环状DNA分子,用酶a切割有3个识别位点的质粒,可得到3种切割产物,D错误。

] 2．下列有关DNA连接酶的叙述,正确的是( )A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来B．E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键,使双链延伸C[DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,从而将它们连接起来。

E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。

T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。

]3．下列关于几种酶作用的叙述,错误的是( )A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合,催化遗传信息的转录C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列,并切割出多种目的基因D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链C[限制酶具有专一性,一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列,并在特定位点切割DNA分子。

DNA连接酶能使不同DNA片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接,重新形成DNA 分子；RNA聚合酶能与基因的特定位点结合,催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板,把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链,复制形成新的DNA分子。

]基因工程中的载体1．种类常用载体：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。

质粒是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外的、具有自我复制能力的、很小的双链环状DNA分子。

2．具备条件(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制,或整合到染色体DNA上,随染色体DNA 进行同步复制。

(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点,供外源基因插入。

(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。

(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用,否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。

说明：一般来说,天然载体不能同时满足所有条件,要对其进行人工改造才可以使用。

3．作用(1)用它作为运输工具,将目的基因送入受体细胞中。

(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

合作探究：(1)细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？提示：①化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质,如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物,也可能是生物,如动植物病毒等。

②功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把目的基因导入受体细胞。

(2)标记基因标记的原理是什么？提示：①前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。

目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。

②过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性,因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。