心肌细胞培养
心肌细胞纯化培养方案——帝沃生物
来源不同，操作人员熟练程度不同，本方案试剂各添加量仅供参考； 4. 本实验最终纯化获取的原代心肌细胞，观察其调动频率、调动幅度以及波峰与波谷时间
间隔等参数值，所使用的设备为 RTCA Cardio(细胞实时无标记多功能分析仪)，如若使 用其他设备检测数据，所获取的数据值参考单位可能与本实验方案有不同，请注意分辨。 5. 0.1%的胰蛋白酶和 0.05%胶原酶 II，都是用 Hanks 液配，是现配现用，直接粉末配制， 分别称好所需的质量，同时溶于 HBSS 中，微孔过滤待用。整个消化过程用的都是此消 化液，即 0.1%的胰蛋白酶和 0.05%胶原酶 II 溶于 HBSS 中配制而成。实验前，称量所需 的胰蛋白酶和胶原酶 II，分别称量好后，放在一起，溶于 HBSS 中，用注射器接上 0.22um 的微孔过滤器，过滤消化液，放入超净台中备用。 6. 本实验方案仅供技术交流之用，实验方案提供者不承担以此实验方案发生的一切事故责 任。
注意：心肌细胞头 2-3 天会抱团，一个集落一个集落地跳，3 天后会慢慢铺开，表现为细
胞团块越来越小，跳动的面积越来越大，到第 4-5 天时可以看到成片跳动，如果种的密度低， 就很难看到成片跳动的景象，多是一个集落一个集落地跳。一般心肌细胞种在塑料基底的培 养皿或培养瓶中，合适的细胞密度下心肌细胞可以从第 2-3 天开始跳动，大约持续到第 4-7 天的，或许更长的时间，而在玻璃基底上（明胶包被）种的细胞有时也能坚持到 7 天，一般 都坚持不了。细胞不聚成一片，细胞纯度可能不够，成纤维细胞等较多，细胞难以连接；心 肌细胞密度较低；细胞的生长状态不好，受到支原体或环境条件的抑制；培养基和血清是否 合适（我们常用 Gibco 10% FBS+Hyclone DMEM），或者这两者存在一些问题，这都是有可 能的。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
心肌细胞
心肌细胞培养实验方法[基本原理]心肌细胞培养用机械方法及酶消化法，将心肌细胞分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结果与功能特性。
[设备及试剂]1 仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱(可用恒温培养箱代替)、离心机、电磁搅拌器、恒温水浴、PH值测定仪、普通及倒置显微镜等,以及一般实验室设备.2 常用试剂有以下几种：培养基：常用Eagle、199、1640、F10、F12、PuckN-16B SM20等。
其中国产的Eagle培养基（MEM)较为常用，根据实验的特殊要求，可选用无糖、缺氧，不同浓度的各种无机离子等特殊培养基。
平衡盐溶液：常用磷酸缓冲盐溶液（P、B、S），无钙镁磷酸缓冲盐溶液（CMF-PBS）及Hank’S液等。
消化液：常用胰蛋白酶（Difco 1:250)，必要时加用胶原酶，弹性蛋白酶等。
抗菌素溶液：取青霉素100万单位，链霉素1g，用双蒸馏水或磷酸缓冲液100ml，配成双抗液备用。
[操作步骤]1 心肌组织的选择：选择乳鼠的心脏。
2 心肌组织块的制备：乳鼠用75％乙醇或1％新洁尔灭消毒皮肤，固定四肢，胸部向上，再用2％碘酊及75％乙醇分别消毒胸腹部皮肤，用虹膜剪剪开胸部皮肤，暴露皮下组织，再用碘酊及乙醇消毒皮下组织，更换剪子及镊子，开胸取心，在盛有磷酸缓冲液或Hanks 液的瓶皿中洗涤后，剪去心房，将心室放入另一平皿中，用吸管吸取磷酸缓冲液反复冲液三次，洗净残留积血。
将一定数量的心室放入三角瓶或离心管的侧壁上，用虹膜剪剪成1mm3碎块，以备消化。
3 心肌细胞悬液的制备：根据实验要求，可选用一次或分次消化法制备细胞悬液。
后者较为常用，在大离心管中放入组织碎块及0.06~0.25% 的胰蛋白酶溶液8~15ml，加入磁棒两根，在磁力搅拌器上，37℃水浴中消化10分钟，自然沉淀，弃去上清，再加入胰蛋白酶液8~15ml，消化10分钟，再用吸管吹打组织块1分钟，自然沉降后，将上清液及沉淀物分别处理。
心肌细胞培养概况
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心肌细胞培养
原代培养的心肌细胞的准备
将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡75%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hank's液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37℃消化10分钟后，加等体积的DMEM全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次37℃20分钟；收集除第一次以外的上清液，1500 r/min 离心15分钟，弃上清，用含10％胎牛血清及青霉素和链霉素(终浓度均为100U/ml)的高糖DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200目筛网过滤去除未消化组织块。
然后按差速贴壁分离法37℃、5%CO
孵育 1-1.5小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化心肌细胞。
细胞计
2
条件下培养。
于培养后12h即可见部数，相同密度接种于培养瓶中，37℃，5%CO
2
分细胞收缩,24h后换液,此时心肌细胞约90%以上都在收缩, 速率达70/min～120/min。
细胞培养72h后用于实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏的主要细胞类型，其功能是维持心脏的收缩和舒张运动。
由于心肌细胞自身的特殊性质，其在病理学和药理学研究中具有重要的作用。
因此，对大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养具有重要的研究价值。
1. 材料与方法将健康的雄性SD大鼠用5%碘酒消毒，取出心脏并用PBS清洗，然后将其切成5mm×5mm的小块。
接着，将心肌块用0.25%胰酶和0.1%胆酸溶液（pH 7.4）在37℃水浴中消化30 min，然后加入完整培养基中停止消化。
用100μm的过滤网过滤后放在离心管中，500g离心5 min，取出混悬液上清液（含心肌细胞）。
将上清液平行于低浓度FBS培养基缓慢滴加到细胞培养瓶中，放置于37℃恒温培养箱中培养。
将细胞瓶中的细胞制备成单层细胞，加入适量的鼠抗α肌动蛋白单克隆抗体进行免疫染色。
观察细胞的形态和免疫染色结果，确定大鼠心肌细胞的纯度。
同时，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting等方法来检测心肌特异性基因和蛋白的表达水平。
1.3 第1代大鼠心肌细胞的培养将细胞瓶中的心肌细胞培养至80%的密度后，用0.25%胰酶溶液（pH 7.4）将细胞处理成单细胞，然后加入适量的完整培养基中，调整至适当的离心管中，进行离心操作。
沉淀细胞，再用适量的完整培养基悬浮细胞，取适量的细胞悬浮液加入到新的细胞培养瓶中，以此种方式连续传代，获得第1代大鼠心肌细胞的纯培养状态。
2. 结果通过以上方法，从大鼠心脏中成功分离出心肌细胞，得到了悬浮液。
悬浮液中的心肌细胞大小大约为10-15μm，可用影像学方法进行精细观察，获得细胞数量约为3×10^6个/ml。
通过α肌动蛋白的免疫染色和心肌特异性基因和蛋白的表达水平的检测，我们成功地鉴定出了大鼠心肌细胞的纯度，并且进一步证明了其心肌细胞的特异性。
通过培养，我们成功地获得了第1代大鼠心肌细胞的纯态，细胞生长状况良好，细胞数量增加较为显著。
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏肌肉的主要细胞类型，具有重要的生理功能。
研究大鼠心肌细胞具有重要的意义，可以探究心血管疾病的发生和发展机制，以及开发相关的药物治疗。
大鼠心肌细胞的分离可通过以下步骤进行：1. 预处理：取出大鼠心脏，迅速放置在冷却的维生素-free Hanks盐溶液中。
然后，用冷却过的Hanks盐溶液洗涤心脏，去除血液和杂质。
2. 细胞分离酶处理：将心脏切成小块，并放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%胆汁酸的预温化酶解缓冲液中。
在37℃的恒温摇床上进行酶解处理。
3. 细胞分离：酶解后的心脏组织经过轻微的摇晃，并用玻璃棒将组织块轻轻破碎。
将破碎的组织悬浮液通过细胞筛过滤器，并用高离心力离心收集上清液。
4. 细胞沉降：将上清液经过离心，去除上清液，留下细胞沉淀。
再次加入含有0.1%胰蛋白酶的预温化酶解缓冲液，并摇动细胞沉淀，使细胞悬浮。
5. 细胞富集：采用密度梯度离心法，将细胞悬液慢慢加入含有离心液的离心管中进行离心。
心肌细胞将沉积在密度梯度的底部。
6. 细胞培养：将心肌细胞的上清液去除，留下沉积的心肌细胞，加入预先准备好的心肌培养基中。
将细胞培养于37℃恒温孵化箱中，并提供适当的营养物质。
1. 形态学鉴定：使用显微镜观察细胞的形态结构。
正常的心肌细胞呈长条状，具有交叉纹理的横纹。
如果细胞形态发生变化，如变形、伸长或成球状，则可能表示细胞出现异常。
2. 免疫细胞化学鉴定：使用免疫荧光染色或免疫组化染色的方法，检测心肌细胞特异性标记物，如肌球蛋白（myosin）等。
正常的心肌细胞应表达这些标记物。
3. 功能鉴定：利用心肌细胞的特殊功能特点，如收缩、钙离子跨膜转运等，进行鉴定。
可通过记录细胞的膜电位变化、细胞的跳动频率等指标来评估细胞功能。
心肌细胞的培养需要特别注意以下事项：1. 培养基的选择：根据不同研究需求选择适当的培养基，如DMEM、Dulbecco改良的培养基等。
培养基应添加适量的血清、营养物质和生长因子，以提供细胞所需的营养和生长环境。
心肌细胞培养进展
522019.08基础研究心肌细胞培养进展李攀阳 王凌霄 高 丽 赵婷婷 宋 爽河南医学高等专科学校 河南省郑州市 451191【摘 要】为进一步提高我国心血管疾病的治疗效果和研究效果，医学界已经加强了对心肌细胞的培养工作，也广泛应用在我国心血管疾病防治研究领域。
对于相关科学研究进展来说，成功培养心肌细胞对其具有重要的影响，而且目前经济细胞培养的技术也得到了广泛关注。
现如今，国内外对于培养心肌细胞的研究比较多，本文主要针对心肌细胞培养进展进行了分析和探讨。
【关键词】心肌细胞；培养；进展在全世界范围内心脏疾病的发生率正呈逐年提高的趋势，对于人类的生命健康产生了重要的威胁，目前根据心脏疾病的治疗方式，主要根据心血管疾病的防治机制以及相关治疗药物进行了大量深入的研究和探讨。
在相关研究中以心肌细胞为主要实验对象，目的是为了进行心肌细胞培育，这也是相关研究的主要目的。
通过体外培养心肌细胞，能够有效的维持心肌细胞原有的结构功能以及特点，也能够减少体液神经等因素对其的影响，因此通过体外培养心肌细胞是一项比较理想的实验方式。
经过国内外相关学者的研究，进一步推进了心肌细胞培养技术的改良和更新，2.2 比较两组排尿情况见表2显示，实验组排尿情况更好，两组具有差异性，统计学含有意义（p<0.05）。
3 讨论神经源性膀胱指控制患者排尿的中枢神经遭到损害，以此出现的排尿障碍问题，其有很多种类型，包括逼尿肌反射亢进、逼尿肌无反射等，不仅给患者日常工作与生活带来不便，还会增加尿路感染的可能性，若不采取有效的措施控制，也会引发肾衰竭等疾病，给患者生命安全带来威胁[5]。
因此，此病应该受到临床的重视，通过有效的措施，改善患者症状，帮助其恢复膀胱功能。
近年来，随着临床技术的不断发展，间歇导尿的优势逐渐显现，其是治疗神经源性膀胱的首选，对于恢复患者膀胱功能有积极作用，其作用主要体现为以下几点：间歇导尿可以解决患者膀胱过度充盈情况，间接的促进膀胱扩张，护理人员通过患者残余尿量，制定合理的导尿计划，有利于引起患者排出残余尿量，加具体内容如下。
009_心肌细胞培养方法详述
心肌细胞培养方法详述试剂配制1、D-Hanks溶液（pH 7.4）：NaCl 8.00gKCl 0.4 gNa 2HPO4•12H2O 0.134gKH2PO4 0.06 gNaHCO3 0.35 gGlucose 2.0g酚红0.02g定容1L，过滤灭菌，4度保存。
2、胰酶消化液（0.07％，700ug/ml）胰酶0.07gD-Hanks溶液100ml注意调节pH到8.0。
配制的时候先溶解，然后放在4度过夜，过滤除菌。
-20度保存。
3、胶原酶消化液（1％）胶原酶 0.1gDMEM/F12 10ml调节pH值到7.5左右。
过滤除菌。
-20度保存。
4、10% DMEM/F12完全培养基 10％FBS，DMEM/F12，加入双抗。
使用前注意补加谷氨酰铵。
5、用于中和的培养基(10％)：180ml DMEM/F1220ml 国产血清使用前加入双抗和谷氨酰铵。
6、BrdU：5-bromo-2’-deoxyurine；Sigma Cat.No. B5002-100mg -20℃保存；分子量307.10。
BrdU存储液（10mM，100*）：称取BrdU 30.7 mg充分溶解于10m1 DMEM中，浓度即为10mM, 无菌条件下以0.22um孔径的滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存。
临用前取10mM BrdU贮液按1: 100加入DMEM培养液中，使BrdU终浓度为0.1mM。
8、Laminin（1MG/ML）sigma lot:L2020：分装每100ul，-80保存。
使用前用PBS稀释100倍，4℃保存。
实验动物准备出生1--3天的小鼠乳鼠，购自北京维通利华公司，一般一次做10只左右的小鼠。
试验前准备：1、高压灭菌解剖器械、弯头吸管、一个烧杯、一个试剂瓶、2个培养皿等，并准备足够的50ml离心管和15ml离心管。
2、D-Hanks平衡液、DMEM/F12、溶解国产胎牛血清及进口血清（在使用前拿出）。
3、0.07％胰酶、0.1％胶原酶。
心肌细胞培养方法详述
心肌细胞培养方法详述配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。
准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。
其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。
新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。
用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。
50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml 以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏组织的主要细胞类型，对于研究心脏生理和病理具有重要意义。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养。
1.1 心肌细胞分离缓冲液的制备材料：胰酶（Sigma）胆汁酸（Sigma）肝素（Sigma）Krebs氏缓冲液（pH 7.4）制备：将1g胰酶、0.5g胆汁酸和10mg肝素混合后加入50ml Krebs氏缓冲液中，搅拌均匀，过滤，滤液称为酶液。
材料：大鼠心脏酶液Krebs氏缓冲液10% FBS器材：离心机冷藏离心管15ml离心管显微镜步骤：1）将新鲜大鼠心脏取出，迅速放入Krebs氏缓冲液中洗涤，去除残留的血液。
2）用冷Krebs氏缓冲液冲洗心脏3次，每次放入小的离心管中。
3）将心脏移入含有酶液的小离心管中，密封，放在离心机上，以适当的速度进行离心，细胞可保持在液体表面，离心时间约15分钟。
4）取出细胞上清，加入等体积的10% FBS，反复吹打分散心肌细胞。
5）收集细胞悬液，显微镜下观察细胞形态，统计细胞形态和数量。
6）以1×105个细胞/ml的浓度培养心肌细胞。
2. 心肌细胞的鉴定材料：FITC-α-肌球蛋白抗体Dil-α-肌球蛋白抗体显微镜步骤：1）将心肌细胞培养在玻片上，用50%乙醇固定，洗涤3次。
2）将细胞孔洞用Dil-α-肌球蛋白抗体标记，加入1/1000浓度的FITC-α-肌球蛋白抗体，封片，显微镜下观察合适的细胞，记录下为肌细胞转化的细胞数量，计算纯度。
材料：DMEM/F12培养基（Hyclone）10% FBS（Gibco）5% CO2孵育箱步骤：1）将心肌细胞密度调节至1×105个细胞/ml，加入10% FBS的DMEM/F12培养基，离心5分钟，移除上清液，加入完整培养基缓慢培养。
2）培养中周期观察心肌细胞的形态和数量，添加必要的药物，并及时更新培养基。
3）心肌细胞培养时间一般在3-5天，在适当的阶段进行下一步实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏的主要细胞类型，负责心脏机械和电生理活动，对心脏健康具有重要的影响。
因此，研究心肌细胞具有重要的应用价值。
在本文中，将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养技术。
1.1 心肌细胞的分离将大鼠心脏取出，用注射器将缓冲液（如PBS）注入主动脉，以清洗心脏内部的血液。
随后，将心脏移至一盛装有酶消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，肌肉组织被消化成单个细胞。
消化时间一般为20-30分钟，消化程度可以调整。
之后用培养液（如DMEM/F12）中和胰蛋白酶的酶消化液，使消化过程终止。
细胞分离后可以使用显微镜进行观察，同时也可以通过显微镜观察细胞形态来判断分离效果。
大鼠心肌细胞通常采用肌钙蛋白T的免疫荧光染色进行鉴定。
此外还可以使用心肌特异性的基因表达来鉴定心肌细胞。
通过PCR扩增，可以检测到只存在于心肌细胞中的基因，如心肌肌钙蛋白T和肌红蛋白等。
在培养前，需要先将心肌细胞分离、鉴定和计数。
以下是大鼠心肌细胞的培养方法：2.1 培养基适用于大鼠心肌细胞的培养基包括：DMEM/F12、M199、MEM、RPMI 1640等培养基，其中DMEM/F12和M199为常用培养基。
大鼠心肌细胞通常以静态培养为主，营养液一般为12%胎牛血清、5%马血清混合的DMEM/F12培养基。
细胞应在涂有胶原质的培养皿中培养。
培养室温度为37℃，5% CO₂的有利条件下培养。
此外，需要注意的是，心肌细胞对缺氧和低氧非常敏感，因此在培养过程中应始终维持培养皿内的氧气浓度。
通常情况下，大鼠心肌细胞的培养状态可以分为初代培养和传代培养。
初代培养的心肌细胞生长很快，但失去了心肌特异性表达，而传代培养中将保留心肌特异性的表达。
在传代培养时，需要定期检测细胞数量，并在细胞繁殖至80-90%时进行传代。
此外，传代时应注意保持培养基的组成和浓度的稳定，避免对细胞造成损伤。
总之，大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养对于心血管疾病研究具有非常重要的意义。
原代心肌细胞培养方法探讨[1] 3
![原代心肌细胞培养方法探讨[1] 3](https://img.taocdn.com/s3/m/cf240a10b7360b4c2e3f64e4.png)
心肌细胞的分离及培养器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶动物：小鼠准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。
培养过程：1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。
2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。
3、PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。
4、放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。
5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。
6、重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。
7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。
8、加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。
9、培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。
10、显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。
11、4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。
或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。
原代心肌细胞培养方法探讨1邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014）周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021）摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。
心肌细胞实训报告总结
一、引言随着生物科学技术的不断发展，细胞培养技术在生物学研究、医学诊断和治疗等领域发挥着越来越重要的作用。
心肌细胞作为心脏的重要组成部分，其结构和功能的研究对于心血管疾病的研究具有重要意义。
本次实训旨在通过培养和观察心肌细胞，加深我们对心肌细胞生物学特性的理解，提高实验操作技能。
以下是本次实训的总结。
二、实训目的1. 学习心肌细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 掌握心肌细胞的形态学观察和生物学特性研究方法。
3. 培养团队合作精神和严谨的科学态度。
三、实训内容1. 心肌细胞培养（1）培养基配制：按照实验要求，配制含有细胞生长因子、维生素、氨基酸、糖等营养成分的培养基。
（2）细胞接种：将培养皿消毒后，用无菌操作技术将心肌细胞接种到培养皿中。
（3）细胞培养：将培养皿放入细胞培养箱中，在适宜的温度、湿度、二氧化碳浓度等条件下培养心肌细胞。
2. 心肌细胞形态学观察（1）显微镜观察：利用显微镜观察心肌细胞的形态、大小、排列等特征。
（2）图像采集：使用图像采集系统记录心肌细胞的形态学变化。
3. 心肌细胞生物学特性研究（1）细胞活力检测：通过MTT法检测心肌细胞的存活率。
（2）细胞凋亡检测：通过TUNEL法检测心肌细胞的凋亡情况。
（3）细胞迁移实验：通过细胞划痕实验检测心肌细胞的迁移能力。
四、实训过程及结果1. 培养基配制按照实验要求，成功配制了含有细胞生长因子、维生素、氨基酸、糖等营养成分的培养基。
2. 细胞接种在无菌操作技术下，将心肌细胞接种到培养皿中，观察到细胞在培养基中生长良好。
3. 细胞培养将培养皿放入细胞培养箱中，在适宜的温度、湿度、二氧化碳浓度等条件下培养心肌细胞。
经过一段时间的培养，观察到心肌细胞形态良好，细胞密度逐渐增加。
4. 形态学观察利用显微镜观察心肌细胞的形态、大小、排列等特征，发现心肌细胞呈长梭形，细胞核呈椭圆形，细胞排列紧密。
5. 生物学特性研究（1）细胞活力检测：MTT法检测结果显示，心肌细胞的存活率较高。
正常心肌细胞实验报告
正常心肌细胞实验报告实验报告：正常心肌细胞实验研究一、实验目的本实验的目的是研究正常心肌细胞的基本特性，包括形态结构、生物化学特性以及生理功能等。
二、实验原理正常心肌细胞是心肌组织的基本构成单位。
其细胞结构与其他细胞类型有所不同，具有丰富的肌纤维和肌丝，同时拥有更多的粒脂体和线粒体。
此外，正常心肌细胞具有自律性、传导性和收缩性等特点，这些特性使心脏能够完成正常的心脏跳动。
三、实验步骤1.通过分离心脏组织，采集正常心肌细胞。
2.将采集到的心肌细胞移植到细胞培养基中，培养适宜时间，使其充分增殖。
3.提取培养基中的正常心肌细胞，进行快速冻存。
4.取出冻存的心肌细胞，使用显微镜观察心肌细胞的形态结构特点。
5.使用细胞实验技术，测量正常心肌细胞的生物化学特性，如养分吸收、代谢状态等。
6.利用生理仪器，观察正常心肌细胞的自律性和传导性特征。
7.使用力学仪器，测量正常心肌细胞的收缩性特性。
四、实验结果及讨论1.形态结构特点研究结果显示，正常心肌细胞具有典型的心肌细胞形态结构，包括长纤维状的肌纤维和肌丝，以及丰富的粒脂体和线粒体。
这些结构特点使正常心肌细胞能够执行心脏收缩功能。
2.生物化学特性研究结果显示，正常心肌细胞具有高度的代谢能力，能够有效吸收养分，维持正常的代谢状态。
此外，正常心肌细胞还具有高度的氧耗能力，需要充足的氧供应来维持其正常功能。
3.自律性和传导性特点研究结果显示，正常心肌细胞具有自发兴奋和传导功能，能够产生心脏跳动的信号，并将信号传递给其他心肌细胞，从而实现心脏的协调收缩。
4.收缩性特性研究结果显示，正常心肌细胞能够快速而有效地收缩，并产生足够的力量推动心脏的血液循环。
其收缩能力与收缩力度可通过力学仪器测量，从而评估心脏的收缩功能状态。
综上所述，正常心肌细胞具有特殊的形态结构、生物化学特性以及生理功能。
了解正常心肌细胞的这些特性对于研究心脏疾病的发生机制以及开发相关治疗方法具有重要意义。
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新生大鼠心肌细胞培养技巧
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中
我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：
1新生大鼠鼠龄的选择新
生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长大量观测表明，选择1~3d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳
2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用
.
消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶
透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏
.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶
I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1g・L1,我们使用的为0.8gL1.胶原酶最好现用现配.
3消化程度的把握
新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感
.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测
.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意
:(1)转速一般控制在60~80rmin1左右
.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织
.(4)适宜温度为35~37℃
.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.
4接种的细胞密度
心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率接种细胞的绝对数量应经精确计算
.
一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.
5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.
因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染
6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞
.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长
.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％上的心肌细胞
.
7 换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48h后换液
.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实
此外，去血清后可用ITS和0.1gL1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响
.
8抗污染措施
除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：
(1)获取心脏时避免剪破消化道
比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会 .(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染
.(3)对于培养心肌细胞的观察、
照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率
9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：
(1)pH值会在过滤后上升0.1~0.3.
(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关
.(3)应及时换液.
(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用
.1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。
后来解剖开后才想起来，本科时候解剖老师说新生儿脏器位置偏低，，后来就在大约第5－6肋骨处插入剪刀尖，横向剪开胸骨，大概开口8ｍｍ就可以挤出心脏了。
每取一个心脏大约1ｍｉｎ。
２，培养基的使用，虽然大多数人用的是DMEM高糖培养基，可是又有人用的是1640，同样也有效果（心肌细胞波动良好），同时实验室里也有师兄正使用1640，我就偷懒，就用1640，可是细胞就是不搏动，后来查了资料才知道，1640的钙离子浓度太低，而DMEM钙离子浓度1.8×1000（－3）。
这是比较适合的浓度。
后来我就自己买了DMEM培养基就可以了，细胞博动的很好看。
３，消化心肌组织是出现絮状物质，没有办法去除，吸出已经消化的细胞时由于絮状物质的干扰不能吸出。
我试着加大离心速率，期待能去除，可是
2000rpm*10min离心后，居然它还是悬浮着。
那次消化心肌非常失败，后来有一次在医院食堂吃饭，同桌的一位脑外博士，提到他消化脑组织，消化过渡的时候也会出现，这样的现象，后来经人指点说的细胞破了，DNA出来了。
哦，我才恍然大悟，原来如此。
以前一味得追求心肌细胞消化的彻底，就把心肌组织剪成肉沫状，……。
以后消化的时候就是不能太小了。
４，在园子里提到两种消化方法，一种是用恒温振荡器，一种用磁棒搅拌，原来以为胰酶的合适温度是37度，我用前者，可是消化结果，细胞数量很少，经过8次每次消化8分钟后，剩余的组织块还是很大。
没有办法了，用后者，在室温20度的情况下消化结果好多了。
５，当我把组织都消化了，什么都没有剩余了，我就把那些液体去离心
1000rpm*10min（园子里一般推荐用的），可是我发觉：离心下来的细胞非常少，冥思苦想。
后来有人提示说，离心标准单位是用g，大约是350g，我就按半径换算了，结果发现350ｇ应该是1500ｒｐｍ。
于是下一次消化时改用了1500ｒｐｍ，细胞就多了。
不死心，把上清去除继续4000ｒｐｍ离心，发觉还是有细胞剩余，不过这些细胞台盼蓝染色存活率比较低约40％以上这些与大家共同讨论，谢谢。
我也是个新手，希望大家能互相帮助。
大鼠心肌细胞分离大鼠心肌细胞比乳鼠心肌难养，用无血清培养基，呈杆状，横纹清楚，在培养基里细胞不搏动。
大鼠心肌细胞分离一般是采用二型胶原酶分离，浓度为1mg/ml（用无钙台氏液配制），同时酶液里加入牛磺酸，BSA。
一般采用Langendorff灌流的方法，大鼠开胸后，迅速取出心脏，放入冰的台氏液中，找到主动脉后，挂上Langendorff 装置，衡流泵灌入无钙台氏液（37度），开始心脏会搏动几下，这样把心脏中的淤血挤出（此处也有人用有钙台氏液流，好让心脏充分搏动，把淤血挤出，不过我们摸索发现只要取心脏到挂上去的时间短，一般搏动几下就能把淤血清楚干净了）。
几分钟后，换酶液开始灌流心脏，一般开始时，心脏较软，待消化一段时间后变硬，继续消化后又变软，且心脏发白，这时候就可以停止消化，将心室剪下，放入KB液中，用剪刀剪碎后，用滴管吹打，取上清，继续加入KB液，吹打，直到上清液不浑浊为止，一般吹打3－4次即可。
将各次上清合并，吹打过滤后，沉降20分钟左右，弃上清，加入无血清培养基（MEM，不含L－谷氨酰胺，并加入肌酸，牛磺酸，BSA，肉毒碱，HEPES），吹打，1000转/分离心半分钟，弃上清，再洗1－2次后，将沉淀加入到6％的BSA中沉降15－20分钟（纯化心肌细胞），然后计数，点板或培养。
此法中如果各步注意无菌操作，最后先用加倍双抗的培养基培养24h后，再换正常培养基，可适用于条件不是很好的试验室。
如果能在板或瓶内加入Laminin处理后，贴壁很好。
如果分离出来的心肌细胞，逐级复钙后培养，状态更好。
最佳状态此中方法能培养7天以上.。