考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用

在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速， 约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳 定。由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系 数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低 检出量为1µg）。由于染色法简单迅速，抗干扰 性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方 面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的 蛋白质快速微量测定方法。
A=lg(1/T)=Kbc
A为吸光度; T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0); c为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度(光程）.
物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸 光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.
测量条件选择
（1）仪器预热是保证仪器准确稳定的重要步骤。 （2）比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。 比色皿与分光光度计应配套使用。 比色皿内盛 液应为其容量的2/3。 （3）选择适宜波长的入射光：由于物质对光有 选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵敏度， 必须选择溶液最大吸收波长的入射光。
灵敏度
0
100
暗盒盖
调波长旋钮
比色皿拉杆
1．调整
（1） 接通电源。 （2） 调波长调节器至所需波长。 （3） 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置
于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透 光率[100%T]。预热20min . 预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开， 使光路切断。
液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，
4000rpm离心10min，合并上清液并定
容至10ml。
2. 蛋白质含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
（三）、结果计算
分光光度计的分类
红外分光光度计: 测定波长范围为 大于760 nm的 红外光区
可见光分光光度计:
测定波长范围为 400~ 760 nm的 可见光区
测定波长范围为 200～400 nm的 紫外光区
紫外分光光度计:
可见光谱
可见光范围内波长和颜色的关系
分光光度计的基本结构
无论哪一类分光光度计都包括：光源、单 色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光 度计各部件的次序如图所示:
入射光 强度 Io 单色器 样品池 透射光 强度 I
光源
检测器 及仪表
光照射到物质上，物质的分子结构决定 哪些特定波长的光被吸收。这一现象符 合符合朗伯－比耳定律。
入射光强度 Io 透射光强度 I
样品浓度c
光程 b
当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部 分被吸收，一部分透过溶液(I)
朗伯—比尔定律:
样品蛋白质含量（ µg/ g鲜重） =
m (µg) × 提 取 液 总 体 积 (ml )
测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）
式中： m为从标准曲线上查得的蛋白质含量， 单位为µg。
【实验步骤】
（一）、标准曲线的制作 1. 取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。
试 剂 试管编号
1
0 100 0
2
20 80 20
3
40 60 40
4
60 40 60
5
80 20 80
6
100 0 100
1000µg/ml标准蛋白溶液 （µl）
0.9%生理盐水（µl） 蛋白质含量（µg/0.1ml）
【注意事项】
1）为了防止光电管疲劳不测定时须将比色皿暗箱盖 打开，使光路切断。 2）比色皿的使用方法： ①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不 要碰比色皿的透光面。 ②每次做完实验时，应立即洗净比色皿。 清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。 必要时可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1∶2）浸泡片刻，再 用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，。 不能用毛刷清洗。 ③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以 保护透光面。 3）在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到 浓的顺序测定，以减小测量误差。
2. 分别向上述各管加入3.0ml考马斯亮蓝 G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后， 测定A595值。 3. 以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐 标，绘制标准曲线。
（二） 样品提取液中蛋白质含量的测定 1.蛋白质提取: 称取样品约200mg，加蒸馏水5ml， 匀浆，4000rpm离心10min， 取上清
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋 白质含量：分光光度的使用
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测
定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作
方法。
【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量 属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸 收峰在465nm；当它与蛋白质通过范 德华键结合成复合物时变为蓝色，其 最大吸收峰移至595nm，而且消光系 数更大。
3．测定 将待测样品的比色皿放入相应的样品穴，轻 轻拉动比色皿座架拉杆，使待测溶液进入光路， 测定。显示值（小数后三位数）即为待测样品的 吸光度值Ａ。 读数后，打开比色皿暗箱盖。 4. 关机 实验完毕，切断电源，将各调节旋钮恢复至 初始位置。将比色皿取出洗净，晾干，存于专用 盒内，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。
2．校正 （1）打开吸收池暗室盖，调节[0% T]旋钮， 使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路， 盖上吸收池盖，调节透光率[100% T] 旋钮， 数字显示为“100.0”。 （2）如果显示不到“100”，则可适当增加电 流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度 后必须重 新校正“0”和“100”。 （3）按（1）连续几次调整“00.0”和 “100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行 吸光度A的测量.
【器材与试剂】
（一）器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3. 移液枪 4. 新Biblioteka Baidu小麦叶片或绿豆芽下胚轴等 （二）试剂 1. 0.9%生理盐水 2. 考马斯亮蓝试剂 3. 1000µg /ml蛋白质标准液
【分光光度法的基本原理和分光光度计的 使用方法】
定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸 收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组 分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的 极少量物质。 应用: 生物化学研究中广泛使用的方法之 一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定 量检测。
（4）控制吸光度A的准确的读数范围：吸光 度控制在0.1~0.8读数范围内时，测量的准确 度较高。 （5）选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪 器工作零点的。无色样品可用蒸馏水作参比 溶液；反之应采用不加样品（加显色剂）的 溶剂作参比溶液。
722型光栅分光光度计使用方法
T/A切换旋钮
显示窗口 电源开关 消光零