开题报告

南华大学本科生毕业设计（论文）开题报告

Scheme 1. Reagents and conditions: i) K2CO3, DMF, 100 °C, 6 h, (ii) SOCl2, reflux, 2 h.

Scheme 2. (iii) (Boc)2O, N2 protection, DCM, ice bath for 20 min, for overnight, (iv) K2CO3, DCM, r.t., 20 min, (v) TFA, DCM, r.t., 5 h, (vi) ArSO2Cl, Et3N, THF, r.t., 20 min.

（2）系列B合成路线

Scheme 3. Reagents and conditions: i) a. K2CO3, CuI, DMSO, 1,10-Phenanthroline, 120-125 °C, 12-24 h, b.

NaOH, H2O, MeOH, (ii) SOCl2, reflux, 2 h.

Scheme 4. (iii) (Boc)2O, N2 protection, DCM, ice bath for 20 min, for overnight, (iv) K2CO3, DCM, r.t., 20 min, (v) TFA, DCM, r.t., 5 h, (vi) ArSO2Cl, Et3N, THF, r.t., 20 min.

三、设计（论文）的研究重点及难点：

加入FXa抑制剂后，对硝基苯胺的产生受到抑制，吸光度降低。用酶标仪测定405 nm 处的OD值，由此可推算出FXa抑制剂对FXa的抑制活性。

2）试验步骤

配制BSA buffer（牛血清白蛋白缓冲液）：取0.01 mol（1.21 g）三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，0.02 mol （1.16 g）氯化钠，0.20 g 牛血清白蛋白，加100 mL三蒸水，摇匀，得到0.1 M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐- 0.2 M 氯化钠- 0.2% 牛血清白蛋白缓冲液(pH = 7.4)，待用。

药品溶液的配制：取10 μmol化合物，加入100 μL DMSO，震荡，使溶解并混匀，得到105μmol/L的化合物母液。按递倍稀释法定量稀释至规定浓度，最终浓度分别为1000 μM，200 μM，40 μM，8 μM，1.6 μM，待用。

FXa抑制活性的测定：于96孔板中，每孔加入10 μL上述已配好的不同浓度的药液（空白组中加5% DMSO 10 μL），和10 μL的0.0625 U/mL的human FXa，以40 μL的BSA缓冲液（pH 7.4）混合均匀。37℃下孵育15 min。之后加入0.75 M 发色底物S-2222（40 μL），震荡10s后，于室温下孵育3 h。酶标仪下测定各孔在405 nm的吸光度。

3）统计学处理：FXa抑制活性= 1-[(OD/min)sample/(OD/min)control]。IC50值由FXa抑制活性和化合物的浓度曲线得出。

（3）初步成药性评价：

体内FXa抑制活性和抗凝血活性：雄性Wistar大鼠禁食过夜。将化合物溶于0.5% 甲基纤维素溶液，通过灌胃给药。控制组大鼠则只口服给予0.5% 甲基纤维素溶液。取血时，将大鼠以氟烷麻醉之后取血，取出的血加柠檬酸钠抗凝。将血样离心，取贫血小板血浆用来测定FXa抑制剂的FXa抑制活性和抗凝血活性。

1）FXa抑制活性：

血浆(5 µL) 与0.1 M Tris-0.2 M NaCl-0.2% BSA buffer (pH 7.4; 40 µL)、H2O (5 µL), 和0.1 U/ml human FXa (10 µL) 混合。加入0.75 M S-2222 (40 µL)之后，FXa对S-2222的酶解反应开始。混合液在室温下搅拌10 S之后，于405 nm下测定光密度的增加值(OD/min)。FXa抑制活性（inhibition %）由以下公式计算出：anti-Xa activity ) = 1 - [(OD/min) of sample/(OD/min) of control]。