转录组的研究技术方法及当前-精选文档
转录组的研究技术方法及当前
转录组的研究技术方法及当前
一、概述
转录组技术是基于分子生物学技术，对特定的物种或细胞样品中所有RNA分子进行直接测定，即对其转录上游的基因表达进行全面性研究的方法。
它是分子生物学的重要组成部分，可用于研究基因的表达模式、表达
调控机制以及基因的结构和功能。
转录组技术也可以揭示特定细胞中不同
类型RNA的表达情况，深入研究基因，从而开发更多的抗病毒和抗癌药物。
二、研究方法及技术
1、基于生物信息学的转录组分析技术
顾名思义，基于生物信息学的转录组分析技术利用生物信息学技术将
转录组数据分析成有意义的结果。
基于生物信息学的转录组分析中最常使
用的技术是最大似然估计、聚类分析、共表达网络分析和差异表达分析。
2、高通量测序技术
高通量测序技术是转录组技术中最重要的技术，包括Illumina测序
和SOLiD测序。
Illumina高通量测序技术不仅可以准确测定出物种或细
胞的所有mRNA，而且可以提供全面性转录组测序数据，从而深入了解转
录组结构和表达模式的变化。
SOLiD测序技术可用于研究基因的表达模式
和调控机制，以及基因功能的结构和变化。
3、芯片技术
DNA芯片测序技术在转录组分析中已经被广泛应用。
转录组的研究技术方法及当前
RNA-seq的特点及应用
• 二代测序在转录组的研究上越来越普 遍, 大有替代先前的基因芯片 (microarrays)和基因表 达系列分析技术(serial analysis of gene expression, SAGE)之趋势。由于测序深度的优势, RNA-seq更 能全 面地揭示生物个体在特定时刻和特定组织的全 局基因表达情况, 如 发现新的转录本、了解基 因表达量、挖掘单核苷酸的多态(singlenucleotide polymorphisms, SNPs)、选择性剪接(alternative splicing)和结构性变异(structural variation)。对于 序列信息有 限的非模式生物, RNA-seq更偏重编码 区域。由于相比于基因组, 重 复元件和高GC区比较 少, 使得拼接相对容易, 所以转录组研究在许 多非模 式植物中得到了广泛应用。
研究转录组的基本方法
• 目前研究转录组的方法主要有:（1）基于杂交技术，如cDNA芯片和寡聚核苷 酸芯片；（2）基于测序技术，如早先给予Sanger测序的SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)和MPSS(Massively Parallel SignaturEST等的测序 工作已升级为代测序技术，第一代测序技术较Sanger测序技术通量更高，运 行时间更短，测序片段更长；（3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序， 现在通常将基于第二代测序技术的转录组测序分析称为RNA-பைடு நூலகம்eq。
(4）高通量测序技术的特点
SAGE及MPSS技术的低通量模式切换至RNA-seq的高通量模式。作为蛋白质组研究 的基础，RNA-seq可以识别比蛋白组高一两个数量级的基因，从而帮助科学家构 建完整的基因表达谱以及蛋白质相互作用网络。RNA-seq对于真核生物的基因表 达调控，癌症等疾病的发生机制和新治疗方案确定，遗传育种等方面的研究具有 不可估量的潜力。
转录组研究方法
转录组研究方法嘿，朋友们！今天咱来聊聊转录组研究方法这档子事儿。
转录组，听起来是不是挺高深莫测的呀？其实啊，就好比是一个大宝藏，等着我们去挖掘其中的奥秘呢！想象一下，细胞就像一个小小的王国，里面有各种各样的“居民”，也就是基因。
而转录组呢，就是这些基因“说话”的记录。
我们要研究转录组，就是要听听这些基因都在说些什么，它们是怎么交流的。
那怎么去研究呢？这可有不少门道呢！首先有一种方法叫 RNA 测序，这就像是给基因的话语来了个超级大记录。
它能把细胞里所有正在表达的 RNA 都测出来，让我们对这个小小的王国里的情况了如指掌。
还有芯片技术呢，这就好像是一个特制的棋盘，每个格子上都对应着一个基因。
通过检测芯片上的信号，我们就能知道哪些基因活跃，哪些基因在偷懒啦！另外，定量 PCR 也是常用的一招。
它就像是一个精准的秤，能准确地测量出特定基因的表达量。
你说神奇不神奇？那研究转录组有啥用呢？哎呀呀，用处可大了去啦！比如说，我们可以通过它来了解疾病是怎么发生的呀。
就像侦探一样，从基因的话语中寻找线索，找到致病的元凶。
再比如，在农业上，我们可以通过研究农作物的转录组，来培育出更好、更抗病虫害的品种。
这不就相当于给农作物来了个超级升级嘛！在生物制药领域，转录组研究更是能帮我们开发出更有效的药物呢！是不是感觉特别厉害？而且哦，随着技术的不断进步，转录组研究方法也在不断地更新换代。
就像我们的手机一样，越来越高级，越来越好用。
总之呢，转录组研究方法就像是一把神奇的钥匙，能打开生命奥秘的大门。
让我们能更深入地了解细胞的世界，为人类的健康和发展做出更大的贡献。
所以啊，大家可别小瞧了它哟！让我们一起努力，去探索更多转录组的奥秘吧！。
转录组学的研究进展
转录组学的研究进展随着现代科技的不断发展，转录组学（transcriptomics）研究成为了生物学研究领域中的重点研究之一。
转录组学是指对特定生物体系中基因转录的整体信息进行研究的一种基因组学研究手段，相对于基因组学、蛋白质组学等方法，转录组学的研究对象更加细节和具体，涉及到生物体系中各种基因转录活动的信息，对于研究生物体系发展、变异、适应环境等生理过程，有着重要的作用。
本文将介绍转录组学的研究进展，包括技术革新、研究领域扩充和对生物学研究带来的影响等方面。
1.技术革新在转录组学的研究中，高通量测序技术的发展是一个重大的进步。
高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指利用测序仪对大量的样本进行DNA或RNA序列的测定，可以快速，准确，高质量地产生大量数据。
这项技术的发展使得研究人员可以轻松地获取更加详细的转录信息，从而更加深入地研究基因转录的机制、变异、调控和调节等方面。
同时，高通量测序技术也可以被广泛应用于生物种类鉴别、基因组测序、癌症基因检测等诸多领域。
2.研究领域扩充转录组学研究并不仅限于植物和动物发育过程的研究。
随着研究的深入，转录组学的研究领域也不断拓展，包括肿瘤学、病理学、医学等领域。
如今，许多与恶性肿瘤有关的研究都基于转录组学的技术展开，这些研究有望帮助研究人员更好地理解肿瘤中，基因转录异常和变异等方面的信息。
3.转录组学与生物学研究的影响随着转录组学的技术和研究方法的不断进步，我们的对生物学的认识也在不断拓展和深化。
通过对转录组学的研究，我们逐渐地发现，基因转录的调控方式非常多样化，包括编码和非编码RNA的调控、表观遗传修饰的调控等。
这些都是我们进一步理解生物发展的重要信息。
另外，对于基因转录异常和变异等信息因为它们的泛滥，会带来很高的数据噪声。
因此，研究人员需要设计更加有效的方法，来从繁多的数据中筛选出真正具备意义的信息，发现新的分子标志和生物学特征且建立生物学特征与疾病之间的联系显得越来越重要。
转录组学 表观组学研究方法和技术路线
转录组学表观组学研究方法和技术路线1. 引言1.1 研究背景转录组学和表观组学作为生物学研究领域的新兴技术，在基因调控和表观遗传学研究中发挥着越来越重要的作用。
随着高通量测序技术的发展和成熟，研究人员可以更深入地了解细胞内基因的表达调控和表观遗传修饰，为解决生物学中的重大科学问题提供了强大的工具和方法。
转录组学研究方法主要关注细胞内所有基因的转录活动，通过测定RNA的种类和数量来揭示基因表达的模式，从而帮助揭示基因调控网络和疾病发生机制。
而表观组学研究方法则更多关注基因组DNA的表观遗传修饰，如DNA甲基化和组蛋白修饰，这些修饰能够影响基因的表达和染色体结构，从而影响细胞功能和生物表现。
在当前生物技术发展的大背景下，转录组学和表观组学的研究方法和技术路线不断完善和创新，为生命科学研究开辟了新的领域。
随着应用的深入和研究者对这些技术的掌握，转录组学和表观组学的未来发展前景广阔，但也面临着一系列挑战和机遇。
【研究背景】中的2000字内容到此结束。
1.2 研究意义研究表观组学和转录组学的方法和技术路线对于理解基因组的调控机制、揭示疾病发生的分子机制，以及发展个性化医学具有重要的意义。
随着高通量测序技术的不断发展，研究者们能够更加全面地解读基因组中的信息，揭示基因和环境之间的相互作用，从而为疾病的预防、诊断和治疗提供更为精准的依据。
表观组学的研究方法能够揭示基因组中的表观修饰在基因表达调控中的作用，为我们理解基因组不同部分之间的相互联系提供了重要线索。
转录组学的研究方法则可以帮助我们了解细胞中基因的表达情况，进一步揭示基因功能和调控机制。
这些研究方法和技术路线的持续发展，为科学家们提供了更多的工具和资源，帮助他们更好地解读基因组中的信息，并将其应用于疾病的研究和治疗中。
深入研究表观组学和转录组学的研究方法和技术路线不仅对于推动基础科学研究具有重要意义，更对于促进医学领域的发展和进步具有积极的意义。
通过这些研究，我们可以更好地理解生命的奥秘，为人类健康和生命质量的提高做出更为重要的贡献。
转录组测序技术的研究和应用进展
转录组测序技术的研究和应用进展一、本文概述随着生命科学的飞速发展，转录组测序技术（RNA-Seq）已成为研究基因表达、转录调控、非编码RNA挖掘等领域的重要手段。
本文旨在全面概述转录组测序技术的原理、发展历程，以及其在生命科学研究中的应用进展。
我们将首先简要介绍转录组测序的基本概念和技术原理，然后重点综述近年来在样本制备、测序平台、数据分析等方面的技术革新，以及这些技术进步如何推动转录组测序在疾病诊断、药物研发、农业生物技术等领域的广泛应用。
我们将讨论当前面临的挑战和未来的发展趋势，以期为读者提供一个全面而深入的理解转录组测序技术的视角。
二、转录组测序技术的基本原理和类型转录组测序技术，也称为RNA测序（RNA-Seq），是一种基于下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术的高通量分析方法，用于研究生物体在特定状态下的所有转录本的集合，即转录组。
该技术的核心原理是将RNA样本转化为适合测序的cDNA文库，然后通过高通量测序平台进行测序，最终获得海量的序列数据。
根据测序策略的不同，转录组测序技术主要分为两种类型：基于总RNA的测序和基于mRNA的测序。
基于总RNA的测序方法可以同时获取编码RNA和非编码RNA的信息，包括mRNA、rRNA、tRNA和miRNA 等。
而基于mRNA的测序则主要关注编码蛋白质的mRNA，通过去除rRNA 等非编码RNA，提高测序的深度和准确性。
根据建库方式的不同，转录组测序还可以分为有参考基因组和无参考基因组两种类型。
对于有参考基因组的生物，可以将测序得到的序列与参考基因组进行比对，分析基因的表达情况、变异情况等。
而对于无参考基因组的生物，则需要通过从头测序（de novo sequencing）的方式，构建该生物的转录组序列，再进行后续的分析。
随着技术的不断发展，转录组测序技术已经广泛应用于生命科学研究的各个领域，包括基因表达分析、基因结构分析、转录本变异分析、非编码RNA研究等。
转录组学 表观组学研究方法和技术路线
转录组学表观组学研究方法和技术路线全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：转录组学和表观组学是现代生物学领域中非常重要的研究方向，通过研究基因的转录和表观调控，揭示生物体内基因的表达模式和调控机制。
本文将介绍转录组学和表观组学的研究方法和技术路线，希望能够为相关领域的研究工作者提供一些参考和帮助。
一、转录组学研究方法和技术路线转录组学是研究特定生物体内所有基因的转录水平和表达模式的学科，可以帮助科研人员深入了解生物体内所有基因的功能和调控关系。
转录组学的研究方法和技术路线主要包括以下几个方面：1. RNA测序技术RNA测序技术是转录组学研究中最为重要的技术之一，可以帮助研究者高通量的分析样本中所有基因的mRNA表达水平。
常见的RNA 测序技术包括Sanger测序、芯片微阵列、RNA-seq等。
RNA测序技术不仅可以揭示不同组织、不同生理状态下的基因表达模式，还可以发现新的基因和转录本。
2. 数据分析和生物信息学技术转录组学研究产生的大量数据需要通过生物信息学技术进行分析和解读。
生物信息学技术包括对RNA测序数据的质控、比对、组装、差异表达基因分析等。
科研人员需要掌握各种生物信息学工具和软件，对转录组学数据进行合理的处理和解读。
3. 功能注释和通路分析转录组学研究的结果需要进一步进行功能注释和通路分析，以揭示基因的功能和调控网络。
常见的功能注释工具包括Gene Ontology （GO）、KEGG Pathway等。
通过对基因的功能进行注释和通路分析，可以更好地理解基因之间的相互作用和调控关系。
4. 转录因子和miRNA分析转录组学研究可以揭示生物体内转录因子和miRNA的作用机制，科研人员可以通过RNA测序数据分析转录因子和miRNA的结合位点，探索其在基因表达调控中的作用。
转录因子和miRNA的分析可以帮助科研人员更好地理解基因表达调控的复杂性和精细性。
表观组学是研究基因表观调控的学科，通过对DNA甲基化、组蛋白修饰等表观标记的分析，揭示基因的表观遗传调控机制。
转录组的研究技术方法及当前
(3)MPSS法的特点
• MPSS是SAGE的改进版，MPSS 技术首先是提取实验样品RNA并反转录为cDNA， 接着将获得的cDNA克隆至具有各种adaptor 的载体库中，并PCR 扩增克隆至 载体库中 的不同cDNA 片段，然后在T4 DNA 聚合酶和ddaptor 的微载体上 进行测序。MPSS 技术对于功能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞 或组织内全部基因的表达特征。MPSS技术对于鉴定致病基因并揭示该基因在 疾病中的作用机制等发挥了重要作用
(4）高通量测序技术的特点
SAGE及MPSS技术的低通量模式切换至RNA-seq的高通量模式。作为蛋白质组研究 的基础，RNA-seq可以识别比蛋白组高一两个数量级的基因，从而帮助科学家构 建完整的基因表达谱以及蛋白质相互作用网络。RNA-seq对于真核生物的基因表 达调控，癌症等疾病的发生机制和新治疗方案确定，遗传育种等方面的研究具有 不可估量的潜力。
RNA-seq的特点及应用
• 二代测序在转录组的研究上越来越普 遍, 大有替代先前的基因芯片 (microarrays)和基因表 达系列分析技术(serial analysis of gene expression, SAGE)之趋势。由于测序深度的优势, RNA-seq更 能全 面地揭示生物个体在特定时刻和特定组织的全 局基因表达情况, 如 发现新的转录本、了解基 因表达量、挖掘单核苷酸的多态(singlenucleotide polymorphisms, SNPs)、选择性剪接(alternative splicing)和结构性变异(structural variation)。对于 序列信息有 限的非模式生物, RNA-seq更偏重编码 区域。由于相比于基因组, 重 复元件和高GC区比较 少, 使得拼接相对容易, 所以转录组研究在许 多非模 式植物中得到了广泛应用。
细胞活动转录组学技术的研究与应用
细胞活动转录组学技术的研究与应用随着科学技术的不断发展，人们对细胞活动的了解也越来越深入。
转录组学技术是一种研究细胞活动的高效手段，通过测量转录本的表达量来探索基因功能、生物过程以及疾病发生与发展的机理。
在近些年的研究中，细胞活动转录组学技术已经成为了生物医学研究领域中一个热点话题。
本文将着重探讨细胞活动转录组学技术的研究与应用。
一、转录组学技术简介转录组学技术是测量某个个体或群体中RNA表达的系统化方法。
RNA是DNA的翻译产物，通过RNA的翻译可以揭示多个方面的生物学信息。
通过转录组学技术可以测量大量的RNA，包括mRNA、非编码RNA、miRNA等。
此技术可以为我们提供有关基因表达的定量和定性信息，进而为生物学研究提供更详尽、准确的定量和定性数据，从而促进我们对生命的认识。
转录组学技术可以分为两类：单细胞转录组学和亚群转录组学。
单细胞转录组学是一种高通量技术，它已成为高分辨率细胞分类学和生物学各方面研究的重要工具。
这是因为，每个细胞类型都有其特定的转录组，因此，分析单个细胞的转录组可以为我们提供详细的细胞类型信息，甚至可以找到某些病理性细胞亚型进而开发更精确的治疗方案。
亚群转录组学则更具挑战性，需要对单细胞信息和其组织或器官结构之间的关联进行探讨，以揭示特定细胞类型及其调控网的分子特性。
二、细胞活动转录组学技术的研究进展近年来，细胞活动转录组学技术已经取得了很大的进展，其中包括以下三个方面。
1. 数据分析技术的优化高通量的转录组技术可以同时测量数以万计的基因，从而提供了关于基因表达的全局信息。
然而，对于这种巨量的数据，传统的分析方法可能不足以分析，因此，对数据分析技术的提高变得尤为必要。
目前的数据分析技术已经能够将转录组学的数据注释到某些特定的细胞类型或生物功能中。
这种分析技术的提升可以加深我们对生命科学的认识，也可以让转录组数据更加准确可靠。
2. 必需细胞转录组的开发一些细胞类型或亚群的分选可能需要基于特定基因表达的标志物才能进行，这就需要开发一系列标记的细胞转录组学技术。
转录组学研究的生物信息学方法
转录组学研究的生物信息学方法随着高通量测序技术的发展，转录组学研究在生物学研究中越来越受到重视。
转录组学研究是指对特定组织或细胞中所有转录本的RNA序列进行分析，以了解基因表达和调控的机制。
转录组学研究需要大量的生物学和计算机科学知识，其中生物信息学方法在数据预处理、基因差异表达分析等方面起着至关重要的作用。
一、数据质控和预处理在进行转录组学研究之前，需要对产生的原始数据进行质量控制和预处理。
这是保证后续分析结果准确性和可靠性的重要步骤。
数据质控包括检查测序数据的质量指标、去除低质量的序列、去除接头序列、去除未知碱基N和剪切读长等。
预处理的过程包括将清洗后的序列比对到参考基因组、利用软件进行转录本拼接、估计基因表达水平和归一化表达矩阵。
二、基因差异表达分析基因差异表达分析是转录组学研究的重要任务之一。
通过比较在两个或多个不同条件下的组织或细胞中的基因表达差异，可以确定哪些基因在特定条件下受到调控。
基因差异表达分析通常包括以下几个步骤：1. 基因定量：将各个样品中基因的表达量数量化。
这个过程中，需要将清洗后的碱基序列比对到一个已知的基因组或转录本组装。
基因表达量的定量可以用TPM（每百万个转录本）或FPKM（每百万个外显子组）进行度量。
2. 差异表达基因的标准化：标准化的目标是将不同样品的基因表达矩阵统一。
这个过程中可以考虑去除一些不需要的变量，例如测序深度、性别、批次效应等，以提高数据准确性。
3. 基因差异表达分析：通过比较在不同条件下的基因差异表达水平，确定在差异条件下基因表达的变化。
常见的方法包括T检验、方差分析、DEseq2、edgeR、limma等方法。
4. 实验验证：基因差异表达的结果需要进行实验验证，确保结果的准确性。
三、基因富集分析基因富集分析是对一组差异表达的基因进行进一步的功能注释和生物学意义解释的分析。
在转录组学研究中，基因富集分析可以通过GO富集分析、KEGG富集分析等方法进行。
转录组的研究技术方法及当前
转录组的研究技术方法及当前转录组研究是通过分析细胞或组织中所有转录的RNA分子的整体来了解基因表达的方法。
它可以揭示细胞或组织在不同生理状态下的基因表达水平和调控机制。
随着高通量测序技术的发展，转录组研究已经成为生物医学研究中的重要手段。
以下是几种常用的转录组研究技术方法及其当前的应用情况。
1. RNA测序（RNA-Seq）技术：RNA-Seq是通过对RNA样本进行DNA 测序来定量和鉴定样本中转录的RNA分子。
它可以全面地检测基因表达水平，并鉴定新的转录本和外显子外剪接。
当前，RNA-Seq已经广泛应用于生物医学研究中，如研究疾病的发生机制、筛选潜在的治疗靶点、评估药物的治疗效果等。
2. microRNA测序（miRNA-Seq）技术：miRNA-Seq是通过对miRNA进行高通量测序来了解miRNA的表达情况。
miRNA是一类短小的非编码RNA 分子，可以调控基因表达。
目前，miRNA-Seq广泛应用于研究miRNA的功能及其在细胞和组织发育、疾病进程中的作用机制。
3.差异表达基因分析：通过比较不同样本间基因的表达量，识别差异表达基因，并进一步分析这些基因的功能和调控网络。
当前，差异表达基因分析已经广泛应用于疾病研究中，如癌症、心脑血管疾病、免疫系统疾病等。
它可以帮助发现新的疾病标志物，并为疾病的诊断和治疗提供新的线索。
4.RNA亚细胞定位分析：通过分离和测序亚细胞成分中的RNA，了解不同RNA分子在细胞中的位置和功能。
这项技术可以帮助揭示RNA分子在细胞和组织发育、疾病发生中的作用机制。
当前，RNA亚细胞定位分析已经广泛应用于神经科学领域，用于研究神经系统的发育、功能和疾病。
除了以上技术方法，当前还有一些新兴的转录组研究技术值得关注，如单细胞转录组测序技术、亚转录组测序技术、全基因组DNA甲基化测序技术等。
这些新技术的出现为转录组研究提供了更全面、更深入的视角，进一步推动了转录组研究的发展。
植物基因转录组学研究的新方法
植物基因转录组学研究的新方法随着科技的不断发展和进步，植物基因转录组学研究的方法也在不断地更新和完善。
目前，研究人员们已经掌握了一些新的方法，从而能够更加深入地探究植物的基因组和转录组信息。
本文将介绍一些当前植物基因转录组学研究中的新方法。
RNA测序技术RNA测序技术是目前应用最广泛的植物基因转录组学研究方法之一。
该技术可以在不需要参考基因组序列的情况下，对RNA样本进行高通量测序。
通过对测序数据的分析，研究人员可以得到RNA的表达信息、新的序列变异以及去表达的RNA转录本等信息。
这些数据可以帮助研究人员深入了解植物基因表达的调控，揭示植物分子机制等信息。
蛋白组学技术蛋白组学技术是对于RNA测序技术的补充和扩展，可以更加深入地了解蛋白质的表达和调控。
蛋白质是植物中的重要组成部分，其不仅在调控细胞内的生理过程中起重要作用，同时也在植物对环境的响应和适应中发挥着重要作用。
为了更好地了解植物蛋白质的表达和调控，研究人员现在利用蛋白组学技术进行研究。
这些技术包括质谱分析、二维凝胶电泳和Western blot等。
通过这些技术，可以获得更详细和更全面的植物蛋白质的表达信息，也可以发现一些植物蛋白质之间的交互作用。
同时，还可以通过研究植物蛋白质组的变化，了解植物对于生长环境的响应机制。
单细胞测序技术传统的RNA测序技术对于个体差异的遮盖效果比较明显，因为样本通常是从多个组织和细胞中获取的。
为了克服这些问题，研究人员现在开始采用单细胞测序技术，从而能够更好地研究不同组织和细胞的转录组信息。
单细胞测序技术是将RNA测序技术和细胞分离技术相结合，对单个细胞的RNA进行高通量测序。
通过这种方法，研究人员可以分析单个细胞中的RNA表达和相应的转录本数据。
这种方法可以帮助研究人员更深入地了解植物细胞之间的差异，研究细胞类型、单个细胞状态的变化，甚至可以探索个体的复杂基因表达变异。
CRISPR / Cas9技术CRISPR/Cas9技术是一种最新的基因编辑技术，可用于快速编辑植物基因组或基因转录组，以探究植物分子机制并改善作物品质和产量。
转录组相关实验技术
转录组相关实验技术实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 目的1、学习PCR 反应的基本原理和实验技术。
2、了解引物设计的一般要求。
原理聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA 片段的一种技术。
利用PCR 技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA 片段，以用于基因工程操作。
PCR 进行的基本条件：⑴DNA 模板（在RT-PCR 中模板是RNA）；⑵引物；⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）⑷Taq DNA 聚合酶PCR 循环由三个步骤组成：⑴变性使模板DNA 解离成单链；⑵退火使引物与模板DNA 所需扩增序列结合；⑶延伸DNA 聚合酶利用dNTP 合成与模板碱基序列互补的DNA 链。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30 个左右循环后，目的片段的扩增可达106 倍。
引物设计：要保证PCR 反应能准确，特异，有效的对引物DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：⑴引物长度：15~25 个核苷酸；⑵CG 含量为40%~60%；⑶Tm 值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算；⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%；⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3，⑹两条引物间配对碱基数小于5 个。
由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。
本实验以实验一中提取的质粒DNA 为模板，进行PCR 扩增，大量得到目的DNA 片段。
试剂与器材一、试剂1、Taq DNA 聚合酶2、10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）3、dNTP4、引物（P1、P2）5、溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml 溴乙啶。
注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
6、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。
二、器材1、PCR 扩增仪2、电泳仪3、台式离心机4、紫外分析仪5、恒温水浴6、凝胶成像系统操作步骤一、PCR 扩增1、按下表加入试剂，并小心混匀。
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(4）高通量测序技术的特点
SAGE及MPSS技术的低通量模式切换至RNA-seq的高 通量模式。作为蛋白质组研究的基础，RNA-seq可以 识别比蛋白组高一两个数量级的基因，从而帮助科学 家构建完整的基因表达谱以及蛋白质相互作用网络。 RNA-seq对于真核生物的基因表达调控，癌症等疾病 的发生机制和新治疗方案确定，遗传育种等方面的研 究具有不可估量的潜力。
RNA-seq的特点及应用
RNA-seq技术的优势
(1)数字化信号：直接测定每个转录本片段序列, 单核 苷酸分辨率的精确度, 可以检测单个碱基差 异、基因 家族中相似基因以及可变剪接造成的不同 转录本的 表达, 同时不存在传统微阵列杂交的荧 光模拟信号带 来的交叉反应和背景噪音问题, 能覆 盖信号超高的动 态变化范围。(2)高灵敏度：能够检 测到细胞中少至 几个拷贝的稀有转录本。(3)任意物 种的全基因组分 析：无需预先设计特异性探针, 因 此无需了解物种基 因信息, 能够直接对任何物种进 行转录组分析, 这对 非模式生物的研究尤为重要, 例如 Wang 等、Xiang 等 和 Vera 等利用 RNA-Seq 技术分别对白粉虱、海 鲈鱼和蝴蝶转录组 进行了研究。同时能够检测未知 基因, 发现新的转 录本, 并精确地识别可变剪切位点 及 cSNP, UTR 区域。
转录组的研究技术方法及当前进展
郑忠巧 生物工程一班 20194129
什么是转录组？
广义转录组（Transcriptome）系指从一种细胞或者 组织的基因组所转录出来的RNA的总和，包括编码 蛋白质的mRNA和各种非编码RNA（rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA,microRNA 和其他非编码RNA 等）。狭义转录组系指所有参与翻译蛋白质的 mRNA 总和。
(3)MPSS法的特点
MPSS是SAGE的改进版，MPSS 技术首先是提取实 验样品RNA并反转录为cDNA，接着将获得的cDNA 克隆至具有各种adaptor 的载体库中，并PCR 扩增 克隆至载体库中 的不同cDNA 片段，然后在 T4 DNA 聚合酶和daptor 的微载体上进行测序。MPSS 技术对于功 能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或 组织内全部基因的表达特征。MPSS技术对于鉴定致 病基因并揭示该基因在疾病中的作用机制等发挥了 重要作用
为什么研究转录组？
转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质 组的纽带，转录水平的调控是最重要也是目前研究 最广泛的生物体调控方式。转录组的研究比基因组 的研究能给出 更高效的有用信息。比如ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ人类基因 组包含有30亿个碱基对，其中大约只有5万个基因转 录成mRNA分子，而转录后的mRNA仅部分被翻译 生成功能性的蛋白 质。与基因组不同，转录组更有 时间空间性。比如， 我们人体大部分细胞具有一模 一样的基因， 而即使同一细胞在不同的生长时期及 生长环境下，其基因表达情况也是不完全相同的。 所以，除了异常的mRNA降解现象（如转录衰减） 以外，转录组反映的是特 定条件下活跃表达的基 因。
研究转录组的基本方法
目前研究转录组的方法主要有:（1）基于杂交技术， 如cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片；（2）基于测序技 术，如早先给予Sanger测序的SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)和MPSS(Massively Parallel Signatur、EST等的测序工 作已升级为代测序技术，第一代测序技术较Sanger 测序技术通量更高，运行时间更短，测序片段更长； （3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序，现 在通常将基于第二代测序技术的转录组测序分析称 为RNA-Seq。
二代测序在转录组的研究上越来越普 遍, 大有替代先 前的基因芯片(microarrays)和基因表 达系列分析技 术(serial analysis of gene expression, SAGE)之趋 势。由于测序深度的优势, RNA-seq更 能全面地揭 示生物个体在特定时刻和特定组织的全 局基因表达 情况, 如发现新的转录本、了解基 因表达量、挖掘单 核苷酸的多态(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)、选择性剪接(alternative splicing)和结构性 变异(structural variation)。对于 序列信息有限的非 模式生物, RNA-seq更偏重编码 区域。由于相比于 基因组, 重复元件和高GC区比较 少, 使得拼接相对容 易, 所以转录组研究在许多非模 式植物中得到了广泛 应用。
（2）SAGE法的特点
SAGE是以Sanger测序为基础用来分析基因群体表达 状态的一项技术。SAGE 技术首先是提取实验样品中 RNA并反转录成cDNA，随后用锚定酶 (Anchoring enzyme)切割双链cDNA，接着将切割 的cDNA 片段与不同的接头连接，通过标签酶酶切 处理并获得得到SAGE 标签，然后PCR 扩增连接 SAGE 标签形成的标签二聚体，最后通过锚定酶切除 接头序列，以形成标签二聚体的多聚体并对其测序. SAGE可以在组织和细胞中定量分析相关基因表达水 平。在差异表达谱的研究中，SAGE可以获得完整的 转录组学图谱以及发现新的基因并鉴定其功能、作 用机制和通路等。
转录组的各个研究方法的特点
（1）基于杂交技术的特点 基于杂交技术的DNA芯片技术只适用于检测已知序 列，却无法捕获新的mRNA。细胞中mRNA的表达 丰度不尽相同，通常细胞中约有不到100种的高丰度 mRNA，其总量占总mRNA一半左右，另一半 mRNA由种类繁多的低丰度mRNA组成。因此由于 杂交技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵 列技术难以检测，也无法捕获到目的基因mRNA表 达水平的微小变化