转录组的研究技术方法及当前-精选文档

转录组的各个研究方法的特点
（1）基于杂交技术的特点 基于杂交技术的DNA芯片技术只适用于检测已知序 列，却无法捕获新的mRNA。细胞中mRNA的表达 丰度不尽相同，通常细胞中约有不到100种的高丰度 mRNA，其总量占总mRNA一半左右，另一半 mRNA由种类繁多的低丰度mRNA组成。因此由于 杂交技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵 列技术难以检测，也无法捕获到目的基因mRNA表 达水平的微小变化
研究转录组的基本方法

目前研究转录组的方法主要有:（1）基于杂交技术， 如cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片；（2）基于测序技 术，如早先给予Sanger测序的SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)和MPSS(Massively Parallel Signature Sequencing),全长cDNA文库和 EST文库的测序分析.现在对cDNA、EST等的测序工 作已升级为代测序技术，第一代测序技术较Sanger 测序技术通量更高，运行时间更短，测序片段更长； （3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序，现 在通常将基于第二代测序技术的转录组测序分析称 为RNA-Seq。

二代测序在转录组的研究上越来越普 遍, 大有替代先 前的基因芯片(microarrays)和基因表 达系列分析技 术(serial analysis of gene expression, SAGE)之趋 势。由于测序深度的优势, RNA-seq更 能全面地揭 示生物个体在特定时刻和特定组织的全 局基因表达 情况, 如发现新的转录本、了解基 因表达量、挖掘单 核苷酸的多态(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)、选择性剪接(alternative splicing)和结构性 变异(structural variation)。对于 序列信息有限的非 模式生物, RNA-seq更偏重编码 区域。由于相比于 基因组, 重复元件和高GC区比较 少, 使得拼接相对容 易, 所以转录组研究在许多非模 式植物中得到了广泛 应用。
(4）高通量测序技术的特点
SAGE及MPSS技术的低通量模式切换至RNA-seq的高 通量模式。作为蛋白质组研究的基础，RNA-seq可以 识别比蛋白组高一两个数量级的基因，从而帮助科学 家构建完整的基因表达谱以及蛋白质相互作用网络。 RNA-seq对于真核生物的基因表达调控，癌症等疾病 的发生机制和新治疗方案确定，遗传育种等方面的研 究具有不可估量的潜力。
RNA-seq的特点及应用
Rຫໍສະໝຸດ BaiduA-seq技术的优势

(1)数字化信号：直接测定每个转录本片段序列, 单核 苷酸分辨率的精确度, 可以检测单个碱基差 异、基因 家族中相似基因以及可变剪接造成的不同 转录本的 表达, 同时不存在传统微阵列杂交的荧 光模拟信号带 来的交叉反应和背景噪音问题, 能覆 盖信号超高的动 态变化范围。(2)高灵敏度：能够检 测到细胞中少至 几个拷贝的稀有转录本。(3)任意物 种的全基因组分 析：无需预先设计特异性探针, 因 此无需了解物种基 因信息, 能够直接对任何物种进 行转录组分析, 这对 非模式生物的研究尤为重要, 例如 Wang 等、Xiang 等 和 Vera 等利用 RNA-Seq 技术分别对白粉虱、海 鲈鱼和蝴蝶转录组 进行了研究。同时能够检测未知 基因, 发现新的转 录本, 并精确地识别可变剪切位点 及 cSNP, UTR 区域。
(3)MPSS法的特点

MPSS是SAGE的改进版，MPSS 技术首先是提取实 验样品RNA并反转录为cDNA，接着将获得的cDNA 克隆至具有各种adaptor 的载体库中，并PCR 扩增 克隆至载体库中 的不同cDNA 片段，然后在 T4 DNA 聚合酶和dGTP 的作用下将PCR产物转换为 单链文库，最后通过杂交将其结合在带有Antiadaptor 的微载体上进行测序。MPSS 技术对于功 能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或 组织内全部基因的表达特征。MPSS技术对于鉴定致 病基因并揭示该基因在疾病中的作用机制等发挥了 重要作用
为什么研究转录组？

转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质 组的纽带，转录水平的调控是最重要也是目前研究 最广泛的生物体调控方式。转录组的研究比基因组 的研究能给出 更高效的有用信息。比如，人类基因 组包含有30亿个碱基对，其中大约只有5万个基因转 录成mRNA分子，而转录后的mRNA仅部分被翻译 生成功能性的蛋白 质。与基因组不同，转录组更有 时间空间性。比如， 我们人体大部分细胞具有一模 一样的基因， 而即使同一细胞在不同的生长时期及 生长环境下，其基因表达情况也是不完全相同的。 所以，除了异常的mRNA降解现象（如转录衰减） 以外，转录组反映的是特 定条件下活跃表达的基 因。
转录组的研究技术方法及当前进展
郑忠巧 生物工程一班 20194129
什么是转录组？

广义转录组（Transcriptome）系指从一种细胞或者 组织的基因组所转录出来的RNA的总和，包括编码 蛋白质的mRNA和各种非编码RNA（rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA,microRNA 和其他非编码RNA 等）。狭义转录组系指所有参与翻译蛋白质的 mRNA 总和。

（2）SAGE法的特点

SAGE是以Sanger测序为基础用来分析基因群体表达 状态的一项技术。SAGE 技术首先是提取实验样品中 RNA并反转录成cDNA，随后用锚定酶 (Anchoring enzyme)切割双链cDNA，接着将切割 的cDNA 片段与不同的接头连接，通过标签酶酶切 处理并获得得到SAGE 标签，然后PCR 扩增连接 SAGE 标签形成的标签二聚体，最后通过锚定酶切除 接头序列，以形成标签二聚体的多聚体并对其测序. SAGE可以在组织和细胞中定量分析相关基因表达水 平。在差异表达谱的研究中，SAGE可以获得完整的 转录组学图谱以及发现新的基因并鉴定其功能、作 用机制和通路等。