二硫键检测方法
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2.3.1.4 MBP-Permatin蛋白中半胱氨酸残基及二硫键数目的测定
L半胱氨酸可于5,5-二巯基双-2硝基甲苯(DTNB)发生硫醇-二硫化物交换反应,在碱性条件下反应显黄色,在412 nm处有强烈吸收峰。该反应可特异地检测-SH,从而定量检测L半胱氨酸含量。
分析MBP标签氨基酸序列可知,该标签蛋白中不含有半胱氨酸,故不影响原核表达的Permatin中半胱氨酸残基的数目。采用DTNB 方法测定样品的巯基数，其方法的主要步骤为：
1）样品先用8 M尿素37℃处理4 h；
2）游离巯基数的测定: 向未经尿素处理的1.0 ml样品(0.38 mg/ml)中加入2 ml Tris-Gly(0.086 M Tris, 0.09 M Gly, pH 8.0)，加入50μl DTNB(10 mM DTNB, 200 mM Tris-HCl, pH 8.0)，5 min后测定412 nm 处的吸光值;
3) 总的巯基数的测定: 向经尿素处理的0.5 ml样品中加入2 ml Tris-Gly，加入50μl β-巯基乙醇（β-ME），37℃温浴1h，加入10 ml 12%三氯乙酸（TCA），37℃温浴1 h，11000 rpm离心30 min，用5 ml 12% TCA重悬沉淀两次，以彻底去除β-ME，最后用2ml Tris-Gly重溶沉淀，加入50μl DTNB溶液，5 min后测定412 nm处的吸光值。
利用公式：μmol SH/g=73.53×A412×D/C进行计算。其中A412是412 nm处的吸光值, D为稀释倍数，C为蛋白浓度, 73.53是一个系数,由106/1.36 x 104得到。