HPLC分离技术

液相色谱分离技术

一、液相色谱分离条件选择

HPLC可供选择的固定相及流动相选择都有自身的特点和应用范围。选择分离类型应根据分离分析的目的、试样的性质和量的多少、现有设备条件等来确定最佳分离方法．

1、依据相对分子质量选择

一般的液相色谱(吸附、分配及离子交换)最适合的相对分子质量范围200—2000．对于相对分子质量大于2000的样品，则用空间排阻色谱较佳．

2、根据溶解性能选择

如果样品可溶于水并属于能离解的物质，以采用离子交换色谱为佳；如果样品溶于烃类(如苯或异辛烷)，则可采用液固吸附色谱；如果样品溶于四氯化碳，则大多数可采用常规的分配或吸附色谱分离；如果样品既溶于水，又溶于异丙醇，则可采用液—液分配色谱，以水和异丙醇的混合物为流动相，以憎水性化合物为固定相．

3、根据分子结构选择

判断样品存在什么官能团．然后确定合适的色谱分离类型．例如，样品为酸、碱化合物，则采用离子交换色谱；样品为脂肪族或芳香族，可采用液—液分配色谱或液—固吸附色谱；异构体采用液—固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的样品可用液—液分配色谱．现在将其

列入表18．10，作为选择分离类型的参考．

4、流动相的选择

a、液相色谱中流动相的一般要求

①化学稳定性好．与样品不发生化学反应；与固定相不发生不可逆作用，应保持色谱柱效或柱的保留性能长期不变．

②对样品组分具有合适的极性和良好的选择性．

③必须与检测器相适应，例如，采用紫外检测器，所选用的检测波长(工作波长)应比溶剂的紫外截止波长更长．所谓溶剂的紫外截止波长是当小于外截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量．表18．11列出了部分常用溶剂的紫外截止波长。

④高纯度，不纯的试剂会引起基线不稳定，或产生“伪峰”．

⑤低粘度，溶剂黏度过高，使压力增加，不利于分离；粘度过低，容易产生气泡；常用低粘度溶剂有丙酮、乙腈、甲醇等．

B、液—固色谱的流动相

在液—固吸附色谱中，流动相称为洗脱剂．对极性大的组分采用极性强的洗脱剂；反之，采用极性弱的洗脱剂．

在实际工作中，溶剂的选择需通过实验来确定，合理配制二元溶剂，精细控制组分的K值，有可能使大多数样品组分实现良好分离．如果组分的K值范围很宽，则应采取梯度洗脱．

C、液—液色谱的流动相

在液—液分配色谱中，流动相与固定相的极性差异越大越好．正相分配色谱的流动相是以烃类(如己烷、庚烷等)为主，加入少量极性溶剂(如氯仿、甲醇等)改变流动相的极性和组成。反相分配色谱流动相是以水为主，再加入能与水混溶的有机溶剂，通过改变有机溶剂的组成，调整试样组分的容量因子，改善分离效率．甲醇是最常用的有机溶剂，其次是乙醇和四氢呋喃．

D、键合相色谱

键合相色谱中固定相很稳定，不容易流失，适合于梯度洗脱．不同键合相色谱流动相的选择可参见表18．7．

在非极性键合相色谱中，若用水—甲醇、水—乙腈溶液为流动相，可分离极性物质；若用水和无机盐的缓冲溶液作流动相，可以分离易离解的物质，如有机酸、有机碱、酚类等．从而克服正相吸附色谱分离这些物质时的柱效低和容易产生拖尾峰等缺点．·在极性键合相色谱中，常在非极性或小极性溶剂(如烃类)中加入适量的极性溶剂(如氯仿、醇、乙腈等)为流动相，分离异构体、极性化合物等．

使用的流动相，和液固色谱、液液色谱使用的流动相有相似之处。

a、溶剂的选择性分组

常见溶剂的极性参数P’和选择性参数Xe、Xd和Xn。当将每种溶剂的三种Xe、Xd和Xn值组成一个三角形坐标时，选择性相似的溶剂分布在三角形平面中的一定区域内，从而构成选择性不同的溶剂分组。图4—6为溶剂选择性分组的三角形坐标图。表4—2列出了依据

溶剂选择性分组的各种有机化合物的类型。

由溶剂选择性分组的三角形坐标图可知，常用溶剂可分为8个选择性不同的特征组，处于同一组中的溶剂具有相似的特性。因此对某一指定的分离，若某种溶剂不能给出良好的分离选择性，就可用另一种其他组的溶剂来替代，从而可明显地改善分离选择性。

对甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醚、氯仿、二氯甲烷、水等常用溶剂，各处于第几选择性组，应有清晰的了解。

b、在键合相色谱中选择流动相的一般原则

在键合相色谱分析中常使用二元混合溶剂作为流动相，此时流动相的极性参数P’，可按下述实例进行计算。二元混合溶剂的极性参数P为：

式中 P’a、Pb’——分别为溶剂A和溶剂B的极性参数，φa、φb％——分别为溶剂A和溶剂B在混合溶剂中所占的体积分数。

在正相键合相色谱中，流动相的主体成分为己烷(或庚烷)，为改善分离的选择性，常加入的优选溶剂为质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚(第1组)；质子给予体氯仿(第Ⅷ组)；偶极溶剂二氯甲烷(第V组)。

在反相键合相色谱中，流动相的主体成分为水。为改善分离的选择性，常加入的优选溶剂为质子接受体甲醇(第Ⅱ组)、质子给予体乙腈(第Ⅵb组)和偶极溶剂四氢呋喃(第Ⅲ组)。

表4—3和表4—4分别列出在正相色谱和反相色谱中使用的某些混合溶剂的特性，表达了当向己烷(或庚烷)、水中加入强洗脱溶剂后，引起溶质容量因子K’下降的倍数。

当使用二元混合溶剂时，在正相色谱的情况下，以正己烷(H)作为流动相主体，其P H’《1，它和极性溶剂A组成H／A混合流动相，若其Pmix’对给定的分离有合适的溶剂强度，即被分离溶质的k’在1～10之间。为改善分离的选择性，欲用另一极性溶剂B代替A，重

新组成H／B混合流动相，在保持极性参数Pmix’不变和已知A组分体积分数фA的条件下，．可按下述计算出将H／A改变为H／B时，所需B组分的体积分数фB。

由于PH’《1 ，可近似认为：

在反相色谱的情况下，水(W)作为流动相的主体，它与极性溶剂M组成W／M二元混合流动相，若其Pmix’给定的分离有合适的溶剂强度，即对样品组分有合适的K’值。为改善分离的选择性，欲用另一极性溶剂T代替M，重新组成W／T混合流动相，在保持Pmix’不变和已知M组分体积分数фm的条件下，也可计算所需T组分的体积分数фT。