质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定
(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定
分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
质粒DNA的提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
质粒提取定量与酶切鉴定
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取定量与酶切鉴定
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
质粒提取定量与酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
质粒提取定量与酶切鉴定
DNA Marker (ladder)
质粒提取定量与酶切鉴定
组成
Loading Buffer 上样缓冲液
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取定量与酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
质粒提取定量与酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• EDTA • 甘油 ……………增大溶液密度 • 溴酚蓝…………指示剂 • 二甲苯胺蓝……指示剂
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，
迁移率
溴酚蓝=300bp
二甲苯胺蓝=4kbp 质粒提取定量与酶切鉴定
➢染色
✓溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB) :3,8-二 氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA 分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射 下呈现红橙荧光,
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒DNA提取与酶切方法的比较研究
结论总的来说，各种质粒DNA提取方法和酶切方法都有其优缺点。在选择方 法时，应根据具体的研究需求和实验条件进行选择。常规提取方法虽然操作繁琐， 但成本低廉且产量高；快速提取方法和生物素法则具有快速、简便和高纯度的优 点，但成本较高。对于酶切方法，单一酶切操作简便但适用范围有限；双酶切和 全酶切则能实现复杂切割，但操作较复杂且成本较高。
（2）双酶切
双酶切是使用两种不同的限制性内切核酸酶对DNA进行切割。该方法可实现 对复杂基因组或多个位点的精确切割，适用范围更广。但是，双酶切操作相对复 杂，需要更多时间进行优化和调整。
（3）全酶切
全酶切是使用一种或多种限制性内切核酸酶以及修饰酶等对DNA进行切割。 该方法可根据实验需求对DNA进行的优点是高度灵活，适用范围广泛。然而，全酶切需要更多的实验设计和操 作技巧，且成本较高。
比较研究
1、操作难易程度及成本
在操作难易程度方面，快速提取方法和生物素法相对简单，而常规提取方法 较为繁琐。在成本方面，生物素法和快速提取方法所需试剂和设备成本较高，而 常规提取方法成本较低。
2、纯度和产量
在纯度方面，生物素法和快速提取方法纯度较高，而常规提取方法纯度相对 较低。在产量方面，常规提取方法和快速提取方法产量较高，而生物素法产量较 低。
质粒DNA提取方法
1、常规提取方法
常规提取方法是一种经典的分步提取方法，包括裂解细胞、分离质粒DNA、 洗涤和纯化等步骤。该方法的主要优点是适用范围广，可从各种细胞中提取质粒 DNA。但是，该方法操作繁琐，提取周期较长，需要使用大量试剂和设备。
2、快速提取方法
快速提取方法是通过优化常规提取方法中的某些步骤，实现快速、简单的质 粒DNA提取。该方法主要优点是操作简便、快速，可减少试剂和设备的使用。但 快速提取方法可能会牺牲一些纯度或产量。
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。
质粒DNA的提取与酶切电泳鉴定.ppt
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温开盖放置1015min，使乙醇挥发殆尽。
10、将沉淀溶于30-50μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中， 储于-20℃冰箱中。
5、加入350μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒离心管5次，出现白色 沉淀，使沉淀混匀， 4℃ 12000rpm 离心10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混 匀，4℃下12000 rpm离心2分钟。
7、将上层水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混 匀后室温放置2分钟，然后4℃下12000 rpm离心5分钟。
2、取2 ml培养液倒入1.5ml EP管中（分次加入，离心）， 4℃ 12000 rpm 离心30s -1min，弃去上清；
3、用涡旋混匀器使菌体沉淀重悬浮于250μl冰预冷的溶液Ⅰ。
4、加入新配制的溶液Ⅱ250μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5次，菌 液变得透亮，以混匀内容物（千万不要振荡）。
11、 酶切鉴定并将没有酶切的质粒与酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。 （酶切体系一般1-2ul提取的质粒，10×buffer，相应的酶，余下加水， 一般鉴定所用的酶切体系建议10ul）
质粒提取关键：
基因组DNA与质粒DNA的有效分离 （碱裂解法）
高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白 质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性 成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状 不溶物质，从而可以通过离心除去。
注意事项:
实验方法
碱裂解法
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
质粒提取及酶切实验的注意事项
质粒提取及酶切实验的注意事项一、前言质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的实验技术。
在执行实验时，需要遵守一些注意事项，以确保实验能够成功并得出可靠的结果。
本文将重点介绍质粒提取和酶切实验中应注意的事项。
二、质粒提取实验的注意事项1.使用高质量的DNA提取试剂：DNA提取试剂的质量对提取的DNA质量和纯度有很大的影响，因此选择高质量的试剂非常重要。
2.应用适当的细胞培养技术：细胞培养技术对于细胞表达和提取相应DNA质量至关重要，因此选择合适的培养条件非常重要。
3.注意DNA的浓度：在质粒提取过程中，需要注意DNA的浓度，因为浓度过低或过高都会影响后续的实验结果。
4.遵守标准协议：在进行质粒提取实验时，必须严格遵守标准协议，包括使用正确的试剂、设备和方法。
5.注意杂质的干扰：在提取质粒的过程中，可能会出现杂质，如蛋白质或RNA。
这些杂质可能会干扰后续实验的结果，因此必须尽可能去除。
三、酶切实验的注意事项1.使用高质量的酶：选择适当的酶是酶切实验成功的关键。
不同的酶适用于不同的DNA序列，因此必须选择合适的酶。
2.注意酶的浓度和反应时间：酶切实验中，酶的浓度和反应时间都对结果有很大的影响，因此必须严格控制这些参数。
3.遵循标准协议：遵循酶切实验的标准协议非常重要，包括所需的材料、浓度、反应时间严格按照说明书进行。
4.注意反应体系的条件：酶切反应过程需要在适当的缓冲液中进行。
必须确保缓冲液的pH、离子浓度、反应温度等条件是合适的。
5.注意合适的质控实验：在酶切反应中，应该与相应的对照样品一起进行，以确保实验的准确性和精确性。
四、总结在分子生物学中进行质粒提取和酶切实验是很常见的实验技术，这些实验的成功非常重要，因为它们是分子生物学实验的基础。
在进行实验前，必须了解每个步骤的重要性和所需的操作技能。
在实验的过程中必须严格按照规定的方法和协议进行。
通过遵守上述注意事项和规程，可以获得高质量的实验结果。
质粒DNA提取与限制性内切酶酶切鉴定
为了检验大肠杆菌质粒是否有目的基因，我们先要用碱法提取出高纯度的大肠杆菌质粒DNA并且进行限制性核酸内切酶酶切，然后，我们要进行酶切产物的电泳以及紫外线分光光度法检测DNA。目前这些技术已经广泛应用于基因克隆技术的检验克隆产物阶段。
二、实验原理
(1)首先利用质粒DNA和染色体DNA分子量的差异来进行的。质粒小，为双链、闭环的超螺旋DNA分子，复性容易，而染色体DNA大，不易复性，导致这两种DNA提取不同的方法。因而利用碱法提取质粒DNA，先从混合物中分离出来，然后逐步纯化即可得。
三、实验基本流程
第一部分
1、将1.5ml大肠杆菌培养液加于EP管，然后以12000rpm×60s离心；
2、弃上清，再重复一次；
3、加入150ul溶液I，充分重悬；
4、加入200ul溶液II，立即、轻柔振荡数次；
5、加入150μl冰溶液III，震荡10s，冰浴3~5min后以12000rpm×10min离心；
4、酶切时加入的DNA溶液体积不能太大，防止DNA溶液中其它成分会干扰酶反应。
5、在紫外分光光度调零的时候，要先选定波长260nm（样品中RNA浓度）或280nm（样品中DNA浓度）。若数值一直在波动，则表明仪器不稳定，应该立即停止使用。
五、实验结果
1、在质粒酶切电泳中，1孔Marker出现多条带状；2孔已酶切质粒出现双条带状，但是短条带比长条带更明显；而3孔未酶切质粒只有一条带状，并且长度介于已酶切质粒两个条带之间。
-
10-
1-质粒DNA酶切较完全；2-有一部分质粒DNA被酶切了，而有另一部分无；3-质粒DNA被酶切了，但是另一部分太少，所以显现清楚；4-未酶切的质粒DNA。
质粒的提取与酶切实验报告
质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的方法，用于提取和分离特定的DNA 分子或者蛋白质分子。
这些分子通常用于进一步的分析和研究，比如测序、克隆、表达、结构分析等。
质粒提取是指从细胞或组织中提取DNA 的过程。
这通常包括将细胞破碎或消化，然后使用不同的化学方法去除蛋白质、脂质和其他污染物，最后得到纯的DNA。
常用的质粒提取方法有沉淀法、超声法、溶剂法、离心法和酶法等。
酶切实验是指使用酶切特定的序列，将DNA 或蛋白质分割成较小的片段的实验。
常用的DNA 酶有限制性内切酶、全基因组酶和多克隆抗体酶，常用的蛋白质酶有蛋白酶K、蛋白酶D 和蛋白酶R。
酶切实验可用于检测和鉴定特定的DNA 序列或蛋白质分子、研究基因组结构和功能、分离和纯化蛋白质分子等。
在进行质粒提取和酶切实验时，应注意实验条件的控制，包括温度、pH 值、酶的活性和浓度、酶的孵育时间和物质的浓度等。
此外，应注意保护样品的纯度，避免受到污染或酶的抑制。
在进行酶切实验时，还应注意使用适当的酶抑制剂来控制酶的活性，以防止不必要的酶切。
在实验报告中，应详细记录实验条件和步骤，并描述样品的特征和纯度。
对于质粒提取实验，应记录使用的提取方法、提取效率和纯度，并对提取的质粒进行简单的鉴定。
对于酶切实验，应记录使用的酶种类和条件、酶切特异性和效率，并对酶切的片段进行简单的鉴定。
总的来说，质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的基础实验，在进行这些实验时应注意实验条件的控制和样品的纯度，并在实验报告中详细记录实验条件和结果。
质粒DNA的提取、酶切及检测
医学课件ppt
10
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；
NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，这是 由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊 结构的相变化所导致。SDS是为下一步 操作做的铺垫。
医学课件ppt
11
溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。
钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不 溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀 更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉 淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大 肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀。 因为基因组DNA太长了。
医学课件ppt
14
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性
12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管
上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心2min，取上清记录体积到一新管
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
医学课件ppt
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II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于 这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都 是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识 别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核 苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8 个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限 制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向 “读”都完全相同。这种酶的切割可以有两 种方式：
质粒DNA的提取、纯化、酶切、电泳、 紫外分光光度法定量测定
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
2.3 核酸分离纯化的总原则：
(1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
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(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
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最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的一般特性：
(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型： 菌毛、抗药性等
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溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验报告：质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。
2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。
3. 学习构建质粒的操作技术，合理选择酶切酶和酶切条件，成功制备目标DNA 片段。
二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子，通常还携带有特定的基因片段。
酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法，主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。
在质粒DNA酶切实验中，需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取，之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应，最终得到目标DNA片段。
三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液，离心5min，弃去上清液，用PBS洗菌2次。
2. 加入200µl胰蛋白酶，37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
3. 加入200µl重组核酸缓冲液，同样37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
4. 加入50µl重组蛋白酶K，65°C水浴下混合反应50min，离心5min（13000r/min），上清液弃掉。
5. 加入50µl除菌水，65°C混匀5min后，离心5min，上清液收集起来，质粒DNA抽提完成。
6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中，加入合适的限制酶进行酶切反应。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。
四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA，并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。
最终，经琼脂糖凝胶电泳检测，成功得到目标DNA片段，质量均匀、纯度高。
五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应，加深了对质粒结构及酶切法原理的理解，并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。
在今后的实验中，将继续加强实验操作，探究更多质粒DNA的构建与酶切方法，为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
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四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）
10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内 容物，将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min，离心10 min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚：氯仿 (1:1)（去蛋白），反复 混匀，12 000r/min，离心5 min，将上清转至另一离心 管中。转移时小心！（total volume: 400 μL）
－ 原核细胞 － 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒（plasmid）
－ 染色体外的稳定遗传因子
－ 双链、闭环的DNA分子，大小1-200 kb 不等 － 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
－ 具有自主复制和转录能力，并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
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一、实验目的
1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法；
2、掌握碱裂解法提取质粒的方法；
3、了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理、方法；
4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。
二、实验原理
1.PCR：
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA 的过程。
①延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链；
②变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链；
③退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
2. 质粒DNA的提取与定量——碱裂解法：
A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；
B、高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；
C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。
D、定量检测原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应；
而且物质对光的吸收是具有选择性的；
各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。
3.酶切鉴定：利用限制性内切酶。
4、琼脂糖凝胶电泳：
A、琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；
B、DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；
C、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。
三、材料与方法：
(一)、材料
1、样品：
菌液(大肠杆菌DH5a菌株)、引物、2*Premix Taq、灭菌离子水、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α
2、试剂：
LB培养基、AXYGEN试剂盒(溶液S1、S2、S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液EB)、电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 500、无菌水、10*M酶切缓冲液Buf R、HindⅢ(15U/ul)、EcoR I (12U/ul)
3、仪器与器材：
PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶成像系统、
台式离心机、紫外分光光度计
(二)、方法
1、PCR:
步骤实际操作
将装有配好的反应液的PCR反应管置于台式离心机中离心
取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂试剂体积(μL)
灭菌去离子水2*Premix Taq 引物1
引物2
菌液
5.5 12.5 1 1 5
将PCR反应管放入PCR仪中，约1小时30分钟。
2、质粒DNA的提取与定量：
3、酶切鉴定：
步骤实际操作
在一个洁净的1.5ml 的EP管中按顺序依次加入以下以下试剂
试剂体积(µl)
无菌水
10*M酶切缓冲液Buf R
质粒DNA
Hind III (15U/ul)
EcoR I (12U/ul)9.0 2.0 7.0 1.0 1.0
用移液枪轻轻混匀(避免产生气泡)，37℃水浴1.5h
4、琼脂糖凝胶电泳：
凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上
样→电泳→取出凝胶→拍照
四、结果与讨论：
(一)、结果：
1、质粒样本吸光度记录： 测定次数
DNA 浓度(μg/ml)
A 260/A 280 1 2 3 平均值 109 111 111 110
1.64 1.66 1.70 1.67
2、第四个电泳实验本组选取的是质粒以及PCR 目的条带。
由上图可见，本组的质粒与PCR 目的条带的电泳结果均比较模糊。
(二)、讨论：
1、结果1.6<A 260/A 280<1.8，说明样品中仍含有蛋白质或者酚,但结果仍在正常范围之内，说明该数值可用于接下来的计算。
质粒
PCR 目的条带
100 250 500 750 1000 1500 2000 3000 5000
2、根据电泳结果显示：质粒呈3个条带，PCR产物是1个条带。
条带较其他结果较模糊，说明所提取的质粒DNA浓度较低。
根据DNA Marker 泳道，可知所提取的质粒DNA大小约为3000bp，是较为准确的。
思考题：
1、碱法提质粒中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的作用？
答：溶液Ⅰ的作用是溶菌。
溶液中含有溶菌酶、EDTA，溶菌酶能溶解细菌的肽聚糖细胞壁，因而具有溶菌作用。
EDTA可以螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用，同时EDTA还可以加强溶菌酶的溶菌效果。
溶液Ⅱ的主要作用是：提高碱环境，使染色体DNA和质粒DNA变性；溶液中的SDS 可以溶解细胞膜，解聚核蛋白并且结合蛋白质形成复合物使蛋白质沉淀下来。
溶液Ⅲ起缓冲液的作用，调节Ph至中性使质粒DNA复性；溶液还提供了高盐环境，有利于大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物沉淀下来。
2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？
答：严格执行操作步骤，避免残留太多杂质；提取质粒DNA时使乙醇尽量挥发干净，以免影响限制酶的活性。