质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定
(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定
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分子生物学实验报告题目:质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名:学号:班级:时间:一、实验目的:1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理:1.质粒DNA的提取——碱变性提取法:提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中,碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单,易于操作,一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法,主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒,具有纯度高、步骤少、方法稳定,且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点,但提取成本高,需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等,沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA,但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中,染色体DNA氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
质粒DNA的提取与酶切鉴定
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4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3-5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞,使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀,冰上放置2~3min; 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液,中和NaOH,以便使部分变性的闭环
试剂: LB培养基 氨苄青霉素贮存液:浓度50-100mg/mL; 溶液I: 50mmol/L葡萄糖,10mmol/L EDTA (pH8.0),
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0); 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用); 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
冰醋酸,28.5mL H2O); RNase A: 10mg/ml; TE缓冲液: 10mmol/L,Tris-HCl, 1mmol/L,EDTA,pH8.0;
5×TBE缓冲液:0.45mol/L Tris-硼酸,0.01 mol/L EDTA, pH 8.0; 10×Loading buffer:1% SDS, 0.05%溴酚兰,50%的甘油; 无水乙醇;70%乙醇; 标准分子量片段; 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa); EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H); 琼脂糖; 溴化乙啶(EB)染色液(10mg/ml)。
质粒复性,而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min,将上清移入另一干净的Ep管中; 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀,室温放 置2min. 8、12000g离心10min,弃上清液,再用70%的乙醇洗涤 一次, 12000g离心1min,离心管倒置于吸水纸上扣干, 然后在中空浓缩系统上干燥质粒; 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物,室温放置直到质粒完全溶解(约8min), 存于-20℃或直接用于酶切。
质粒提取定量与酶切鉴定
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三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ~3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取定量与酶切鉴定
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上,并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶,其识别位点长度为 4~6个核苷酸的反向重复序列。
质粒提取定量与酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1:DNA Marker( 5 l ) 2:提取的质粒DNA ( 5 l ) 3:质粒DNA酶切产物 ( 10 l )
质粒提取定量与酶切鉴定
DNA Marker (ladder)
质粒提取定量与酶切鉴定
组成
Loading Buffer 上样缓冲液
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取定量与酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
质粒提取定量与酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• EDTA • 甘油 ……………增大溶液密度 • 溴酚蓝…………指示剂 • 二甲苯胺蓝……指示剂
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中,
迁移率
溴酚蓝=300bp
二甲苯胺蓝=4kbp 质粒提取定量与酶切鉴定
➢染色
✓溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB) :3,8-二 氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐,能插入DNA 分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射 下呈现红橙荧光,
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
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(2) 挑选单菌落,在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 (100 g /ml氨苄青霉素),200-300 rpm,37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液(其余菌液加入25%的灭菌甘油,放入对 应编号的1.5 ml离心管中,-70℃ 下作菌种保存),5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜,加入100 l预冷的溶液I,悬浮沉淀,室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II,边加边震荡,但不能剧烈, 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III,震荡混匀,冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液,加入两倍体积的预冷无水乙醇,12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀,空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解,用紫外分光光度计进行DNA含量 测定,EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制: 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒DNA提取与酶切方法的比较研究
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结论总的来说,各种质粒DNA提取方法和酶切方法都有其优缺点。在选择方 法时,应根据具体的研究需求和实验条件进行选择。常规提取方法虽然操作繁琐, 但成本低廉且产量高;快速提取方法和生物素法则具有快速、简便和高纯度的优 点,但成本较高。对于酶切方法,单一酶切操作简便但适用范围有限;双酶切和 全酶切则能实现复杂切割,但操作较复杂且成本较高。
(2)双酶切
双酶切是使用两种不同的限制性内切核酸酶对DNA进行切割。该方法可实现 对复杂基因组或多个位点的精确切割,适用范围更广。但是,双酶切操作相对复 杂,需要更多时间进行优化和调整。
(3)全酶切
全酶切是使用一种或多种限制性内切核酸酶以及修饰酶等对DNA进行切割。 该方法可根据实验需求对DNA进行的优点是高度灵活,适用范围广泛。然而,全酶切需要更多的实验设计和操 作技巧,且成本较高。
比较研究
1、操作难易程度及成本
在操作难易程度方面,快速提取方法和生物素法相对简单,而常规提取方法 较为繁琐。在成本方面,生物素法和快速提取方法所需试剂和设备成本较高,而 常规提取方法成本较低。
2、纯度和产量
在纯度方面,生物素法和快速提取方法纯度较高,而常规提取方法纯度相对 较低。在产量方面,常规提取方法和快速提取方法产量较高,而生物素法产量较 低。
质粒DNA提取方法
1、常规提取方法
常规提取方法是一种经典的分步提取方法,包括裂解细胞、分离质粒DNA、 洗涤和纯化等步骤。该方法的主要优点是适用范围广,可从各种细胞中提取质粒 DNA。但是,该方法操作繁琐,提取周期较长,需要使用大量试剂和设备。
2、快速提取方法
快速提取方法是通过优化常规提取方法中的某些步骤,实现快速、简单的质 粒DNA提取。该方法主要优点是操作简便、快速,可减少试剂和设备的使用。但 快速提取方法可能会牺牲一些纯度或产量。
质粒的提取及酶切实验报告
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质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒,通过酶切实验检测质粒DNA片段长度,并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取:使用特定的提取试剂,先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA;
2、质粒DNA酶切:采用酶切的方法,对质粒DNA进行切割,形成小片段;
3、质粒DNA测序:采用测序仪对质粒DNA片段进行测序,从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂:主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成;
2、PCR反应液:主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成;
3、酶:主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成;
4、测序仪:用于测序质粒DNA的片段长度;
四、实验步骤
1、提取质粒DNA:将实验样品放入提取试剂中,加热30分钟,然后用混合物洗涤一次,最后离心得到清澈的液体,含有提取的质粒DNA;
2、进行PCR反应:将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中,在适当温度下反应10分钟;
3、酶切:将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中,在规定温度下酶切1小时;
4、离心质粒DNA片段:将酶切后的反应液离心,以得到质粒DNA片段;
5、进行测序:将质粒DNA片段放置于测序仪中,逐一测序后得到结果;
五、实验结果及分析
实验结果:
质粒DNA片段长度:
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
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实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中,大多是双联的共价闭合环状DNA分子,长度可以从1kb 到200kb不等,是染色体外寄生性的自主复制子,在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中,为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA,通常使用松弛型(其复制受宿主的控制不严格,在宿主细胞中拷贝数较多)质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多,常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下,染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性;质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离,当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时,变形的质粒DNA又恢复到原来的构型,通过离心保留在溶液中,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的网状结构,与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中,由于各种因素的影响,同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型:①超螺旋型,即共价闭合环状DNA(cccDNA);②一条链发生一处或多处断裂,致使另一条链发生自由旋转,分子内的扭曲折叠消失,形成松弛的分子即开环DNA(ocDNA);③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中,cccDNA由于扭曲折叠,体积很小,在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小,迁移速度最快;ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状,迁移速度较慢;线状DNA受到的阻力最大,迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,除受分子构型的影响,还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时,应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应,分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异,由此将不同构型的质粒DNA 分开。
质粒DNA的提取与酶切电泳鉴定.ppt
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9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温开盖放置1015min,使乙醇挥发殆尽。
10、将沉淀溶于30-50μl TE缓冲液(pH8.0,含20μg/mlRNaseA)中, 储于-20℃冰箱中。
5、加入350μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,反复颠倒离心管5次,出现白色 沉淀,使沉淀混匀, 4℃ 12000rpm 离心10分钟。
6、上清液移入干净离心管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混 匀,4℃下12000 rpm离心2分钟。
7、将上层水相移入干净离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混 匀后室温放置2分钟,然后4℃下12000 rpm离心5分钟。
2、取2 ml培养液倒入1.5ml EP管中(分次加入,离心), 4℃ 12000 rpm 离心30s -1min,弃去上清;
3、用涡旋混匀器使菌体沉淀重悬浮于250μl冰预冷的溶液Ⅰ。
4、加入新配制的溶液Ⅱ250μl,盖紧管口,快速温和颠倒离心管5次,菌 液变得透亮,以混匀内容物(千万不要振荡)。
11、 酶切鉴定并将没有酶切的质粒与酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。 (酶切体系一般1-2ul提取的质粒,10×buffer,相应的酶,余下加水, 一般鉴定所用的酶切体系建议10ul)
质粒提取关键:
基因组DNA与质粒DNA的有效分离 (碱裂解法)
高pH使质粒DNA和染色体DNA变性,同时沉淀蛋白 质。再将pH值调至中性,质粒DNA较小,很容易复性 成双链。而染色体DNA较大,不会复性,缠结成网状 不溶物质,从而可以通过离心除去。
注意事项:
实验方法
碱裂解法
质粒DNA的提取、纯化及验证
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质粒DNA的提取、纯化及验证姓名:肖风学号:2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用,掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法,即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理,凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中,碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单,易于操作,一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白,可通过酚/氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
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限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度:主要污染DNA 的某些物质,如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统:主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积:一般应尽量小,且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度:温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ,在 Taq酶作 用下,以dNTP 为原料,引物 为复制起点, 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性,双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度,使合成 引物在低温 (35-70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右),与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度(Ratio=A260/A280)
• Ratio= 1.8 • Ratio>1.9 • Ratio<1.6
质粒提取及酶切实验的注意事项
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质粒提取及酶切实验的注意事项一、前言质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的实验技术。
在执行实验时,需要遵守一些注意事项,以确保实验能够成功并得出可靠的结果。
本文将重点介绍质粒提取和酶切实验中应注意的事项。
二、质粒提取实验的注意事项1.使用高质量的DNA提取试剂:DNA提取试剂的质量对提取的DNA质量和纯度有很大的影响,因此选择高质量的试剂非常重要。
2.应用适当的细胞培养技术:细胞培养技术对于细胞表达和提取相应DNA质量至关重要,因此选择合适的培养条件非常重要。
3.注意DNA的浓度:在质粒提取过程中,需要注意DNA的浓度,因为浓度过低或过高都会影响后续的实验结果。
4.遵守标准协议:在进行质粒提取实验时,必须严格遵守标准协议,包括使用正确的试剂、设备和方法。
5.注意杂质的干扰:在提取质粒的过程中,可能会出现杂质,如蛋白质或RNA。
这些杂质可能会干扰后续实验的结果,因此必须尽可能去除。
三、酶切实验的注意事项1.使用高质量的酶:选择适当的酶是酶切实验成功的关键。
不同的酶适用于不同的DNA序列,因此必须选择合适的酶。
2.注意酶的浓度和反应时间:酶切实验中,酶的浓度和反应时间都对结果有很大的影响,因此必须严格控制这些参数。
3.遵循标准协议:遵循酶切实验的标准协议非常重要,包括所需的材料、浓度、反应时间严格按照说明书进行。
4.注意反应体系的条件:酶切反应过程需要在适当的缓冲液中进行。
必须确保缓冲液的pH、离子浓度、反应温度等条件是合适的。
5.注意合适的质控实验:在酶切反应中,应该与相应的对照样品一起进行,以确保实验的准确性和精确性。
四、总结在分子生物学中进行质粒提取和酶切实验是很常见的实验技术,这些实验的成功非常重要,因为它们是分子生物学实验的基础。
在进行实验前,必须了解每个步骤的重要性和所需的操作技能。
在实验的过程中必须严格按照规定的方法和协议进行。
通过遵守上述注意事项和规程,可以获得高质量的实验结果。
质粒DNA提取与限制性内切酶酶切鉴定
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为了检验大肠杆菌质粒是否有目的基因,我们先要用碱法提取出高纯度的大肠杆菌质粒DNA并且进行限制性核酸内切酶酶切,然后,我们要进行酶切产物的电泳以及紫外线分光光度法检测DNA。目前这些技术已经广泛应用于基因克隆技术的检验克隆产物阶段。
二、实验原理
(1)首先利用质粒DNA和染色体DNA分子量的差异来进行的。质粒小,为双链、闭环的超螺旋DNA分子,复性容易,而染色体DNA大,不易复性,导致这两种DNA提取不同的方法。因而利用碱法提取质粒DNA,先从混合物中分离出来,然后逐步纯化即可得。
三、实验基本流程
第一部分
1、将1.5ml大肠杆菌培养液加于EP管,然后以12000rpm×60s离心;
2、弃上清,再重复一次;
3、加入150ul溶液I,充分重悬;
4、加入200ul溶液II,立即、轻柔振荡数次;
5、加入150μl冰溶液III,震荡10s,冰浴3~5min后以12000rpm×10min离心;
4、酶切时加入的DNA溶液体积不能太大,防止DNA溶液中其它成分会干扰酶反应。
5、在紫外分光光度调零的时候,要先选定波长260nm(样品中RNA浓度)或280nm(样品中DNA浓度)。若数值一直在波动,则表明仪器不稳定,应该立即停止使用。
五、实验结果
1、在质粒酶切电泳中,1孔Marker出现多条带状;2孔已酶切质粒出现双条带状,但是短条带比长条带更明显;而3孔未酶切质粒只有一条带状,并且长度介于已酶切质粒两个条带之间。
-
10-
1-质粒DNA酶切较完全;2-有一部分质粒DNA被酶切了,而有另一部分无;3-质粒DNA被酶切了,但是另一部分太少,所以显现清楚;4-未酶切的质粒DNA。
质粒的提取与酶切实验报告

质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的方法,用于提取和分离特定的DNA 分子或者蛋白质分子。
这些分子通常用于进一步的分析和研究,比如测序、克隆、表达、结构分析等。
质粒提取是指从细胞或组织中提取DNA 的过程。
这通常包括将细胞破碎或消化,然后使用不同的化学方法去除蛋白质、脂质和其他污染物,最后得到纯的DNA。
常用的质粒提取方法有沉淀法、超声法、溶剂法、离心法和酶法等。
酶切实验是指使用酶切特定的序列,将DNA 或蛋白质分割成较小的片段的实验。
常用的DNA 酶有限制性内切酶、全基因组酶和多克隆抗体酶,常用的蛋白质酶有蛋白酶K、蛋白酶D 和蛋白酶R。
酶切实验可用于检测和鉴定特定的DNA 序列或蛋白质分子、研究基因组结构和功能、分离和纯化蛋白质分子等。
在进行质粒提取和酶切实验时,应注意实验条件的控制,包括温度、pH 值、酶的活性和浓度、酶的孵育时间和物质的浓度等。
此外,应注意保护样品的纯度,避免受到污染或酶的抑制。
在进行酶切实验时,还应注意使用适当的酶抑制剂来控制酶的活性,以防止不必要的酶切。
在实验报告中,应详细记录实验条件和步骤,并描述样品的特征和纯度。
对于质粒提取实验,应记录使用的提取方法、提取效率和纯度,并对提取的质粒进行简单的鉴定。
对于酶切实验,应记录使用的酶种类和条件、酶切特异性和效率,并对酶切的片段进行简单的鉴定。
总的来说,质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的基础实验,在进行这些实验时应注意实验条件的控制和样品的纯度,并在实验报告中详细记录实验条件和结果。
质粒DNA的提取、酶切及检测

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溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS;
NaOH是最佳的溶解细胞的试剂,这是 由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊 结构的相变化所导致。SDS是为下一步 操作做的铺垫。
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溶液III,3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。
钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不 溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀 更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉 淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,大 肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀。 因为基因组DNA太长了。
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加入150uL溶液III(轻轻混匀),冰上静置5min质粒DNA复性
12000rpm,离心5min,取上清记录体积到一新管
上清加等体积的酚:氯仿:异戊醇(振荡混匀)
12000rpm,离心15min,取上清记录体积到一新管
(可省略)上清加等体积的氯仿:异戊醇(振荡混匀)
12000rpm,离心2min,取上清记录体积到一新管
❖ 用一个字母代表菌株或型,如流感嗜血菌 Rd菌株用d,即Hind。
❖ 如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同 的限制与修饰体,则以罗马数字表示,如 HindⅠ, HindⅡ,HindⅢ等。
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II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序, 并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于 这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都 是专一的。因此,这种限制性内切酶是DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识 别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核 苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8 个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限 制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序, 即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向 “读”都完全相同。这种酶的切割可以有两 种方式:
质粒DNA的提取、纯化、酶切、电泳、 紫外分光光度法定量测定
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② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。(保护作用) ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围(缓冲作 用)
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溶液II:由SDS(十二烷基硫酸钠)与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性(裂解细胞和蛋白质变性作用) ② NaOH(PH>12)的作用是破坏氢键,使DNA分子变性(DNA变 性作用)
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有:超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
2.3 核酸分离纯化的总原则:
(1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染(蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂,分子就能 发生旋转而消除链的张力,形成松弛型的环状分子。
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(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
如果两条链均断开,即为线状DNA。
电泳时,三者泳动速度大小关系(???)
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最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的一般特性:
(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型: 菌毛、抗药性等
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溶液III:HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性,分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性,使染色体DNA 变性而发生缠绕,并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐,并与蛋白质形成
沉淀而除去;溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
质粒dna酶切实验报告
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质粒dna酶切实验报告实验报告:质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。
2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。
3. 学习构建质粒的操作技术,合理选择酶切酶和酶切条件,成功制备目标DNA 片段。
二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子,通常还携带有特定的基因片段。
酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法,主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。
在质粒DNA酶切实验中,需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取,之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应,最终得到目标DNA片段。
三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液,离心5min,弃去上清液,用PBS洗菌2次。
2. 加入200µl胰蛋白酶,37°C水浴混合反应5min,离心1min,上清液弃掉。
3. 加入200µl重组核酸缓冲液,同样37°C水浴混合反应5min,离心1min,上清液弃掉。
4. 加入50µl重组蛋白酶K,65°C水浴下混合反应50min,离心5min(13000r/min),上清液弃掉。
5. 加入50µl除菌水,65°C混匀5min后,离心5min,上清液收集起来,质粒DNA抽提完成。
6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中,加入合适的限制酶进行酶切反应。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。
四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA,并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。
最终,经琼脂糖凝胶电泳检测,成功得到目标DNA片段,质量均匀、纯度高。
五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应,加深了对质粒结构及酶切法原理的理解,并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。
在今后的实验中,将继续加强实验操作,探究更多质粒DNA的构建与酶切方法,为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
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四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C,190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min,弃上清,收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体(充分振荡),室温(或冰浴)
10min 加入200uL溶液II(轻轻混匀),冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中,充分混匀,室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ(新鲜配制),盖紧管盖,混匀内 容物,将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min,离心10 min,将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚:氯仿 (1:1)(去蛋白),反复 混匀,12 000r/min,离心5 min,将上清转至另一离心 管中。转移时小心!(total volume: 400 μL)
- 原核细胞 - 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒(plasmid)
- 染色体外的稳定遗传因子
- 双链、闭环的DNA分子,大小1-200 kb 不等 - 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
- 具有自主复制和转录能力,并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8):
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸, 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L,Tris-HCl, 1mmol/L,EDTA , pH8.0, * 100%乙醇与70%乙醇
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一、实验目的
1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;
2、掌握碱裂解法提取质粒的方法;
3、了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理、方法;
4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。
二、实验原理
1.PCR:
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以DNA为模板,特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外复制DNA 的过程。
①延伸:溶液反应温度升至中温72℃,在 Taq酶作用下,以dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链;
②变性:加热使模板DNA在高温下90℃-95变性,双链解链;
③退火:降低溶液温度,使合成引物在低温(35-70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右),与模板DNA互补退火形成部分双链。
2. 质粒DNA的提取与定量——碱裂解法:
A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异;
B、高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA变性;
C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心形成沉沉淀去除。
D、定量检测原理:物质在光的照射下会产生对光的吸收效应;
而且物质对光的吸收是具有选择性的;
各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。
3.酶切鉴定:利用限制性内切酶。
4、琼脂糖凝胶电泳:
A、琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度;
B、DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动;
C、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。
不同的DNA,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。
三、材料与方法:
(一)、材料
1、样品:
菌液(大肠杆菌DH5a菌株)、引物、2*Premix Taq、灭菌离子水、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α
2、试剂:
LB培养基、AXYGEN试剂盒(溶液S1、S2、S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液EB)、电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 500、无菌水、10*M酶切缓冲液Buf R、HindⅢ(15U/ul)、EcoR I (12U/ul)
3、仪器与器材:
PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶成像系统、
台式离心机、紫外分光光度计
(二)、方法
1、PCR:
步骤实际操作
将装有配好的反应液的PCR反应管置于台式离心机中离心
取0.2 ml PCR反应管一只,用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂试剂体积(μL)
灭菌去离子水2*Premix Taq 引物1
引物2
菌液
5.5 12.5 1 1 5
将PCR反应管放入PCR仪中,约1小时30分钟。
2、质粒DNA的提取与定量:
3、酶切鉴定:
步骤实际操作
在一个洁净的1.5ml 的EP管中按顺序依次加入以下以下试剂
试剂体积(µl)
无菌水
10*M酶切缓冲液Buf R
质粒DNA
Hind III (15U/ul)
EcoR I (12U/ul)9.0 2.0 7.0 1.0 1.0
用移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37℃水浴1.5h
4、琼脂糖凝胶电泳:
凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上
样→电泳→取出凝胶→拍照
四、结果与讨论:
(一)、结果:
1、质粒样本吸光度记录: 测定次数
DNA 浓度(μg/ml)
A 260/A 280 1 2 3 平均值 109 111 111 110
1.64 1.66 1.70 1.67
2、第四个电泳实验本组选取的是质粒以及PCR 目的条带。
由上图可见,本组的质粒与PCR 目的条带的电泳结果均比较模糊。
(二)、讨论:
1、结果1.6<A 260/A 280<1.8,说明样品中仍含有蛋白质或者酚,但结果仍在正常范围之内,说明该数值可用于接下来的计算。
质粒
PCR 目的条带
100 250 500 750 1000 1500 2000 3000 5000
2、根据电泳结果显示:质粒呈3个条带,PCR产物是1个条带。
条带较其他结果较模糊,说明所提取的质粒DNA浓度较低。
根据DNA Marker 泳道,可知所提取的质粒DNA大小约为3000bp,是较为准确的。
思考题:
1、碱法提质粒中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的作用?
答:溶液Ⅰ的作用是溶菌。
溶液中含有溶菌酶、EDTA,溶菌酶能溶解细菌的肽聚糖细胞壁,因而具有溶菌作用。
EDTA可以螯合金属离子,抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用,同时EDTA还可以加强溶菌酶的溶菌效果。
溶液Ⅱ的主要作用是:提高碱环境,使染色体DNA和质粒DNA变性;溶液中的SDS 可以溶解细胞膜,解聚核蛋白并且结合蛋白质形成复合物使蛋白质沉淀下来。
溶液Ⅲ起缓冲液的作用,调节Ph至中性使质粒DNA复性;溶液还提供了高盐环境,有利于大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物沉淀下来。
2、结合实验情况,如何提高限制性酶切的反应效率?
答:严格执行操作步骤,避免残留太多杂质;提取质粒DNA时使乙醇尽量挥发干净,以免影响限制酶的活性。