生物化学实验技术PowerPointPresenta.pptx
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聚糖凝胶混匀，倾入层 析柱内，静止后分层， 凝胶高度要在柱高的 1/3~3/4之间。当液面接 近凝胶上表面时将出口 胶管夹紧待用。
注意：装柱要均匀，不要有气 泡和分层，凝胶面要平整
（2）加样：
向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴， 用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸 出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶表面。 待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用 乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部 分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至 洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表 面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至 凝胶面以下。
• 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释 成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混 匀，按上述方法测其吸光度。
【结果与分析】
• 1．根据标准曲线查出蛋wenku.baidu.com质浓度。
• 2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适 当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm 处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质 浓度。
【实验目的】
1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法 和原理；
2．熟悉盐析和层析的基本操作； 3． 掌握离心机的正确使用方法。
【仪器试剂】
试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、 层析柱、反应板；血清、PBS液、葡 聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸 铵溶液。
【实验原理 】 1.盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。
• 2．标准曲线的制作：取试管6只，按下表操作
管号 1
2
3
4
5
6
蛋白标准 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
液（ml）
生理盐水
（ml） 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0
• 混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光 径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光 度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白 质的浓度为横坐标绘制标准曲线。
（3）收集：
加样同时可进行收集，每管收集1ml。 收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶 和尼龙布等。
⑷ 检测：准备反应板两块。将12管收集液 各取1 滴分别放入反应板的12个凹孔。一 块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+ 者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无 呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内 加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。
• 如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度 （mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。
【注意事项】
• 1．加量要准确。 • 2．比色皿的正确应用。 • 3．结果重复3次，取平均值。
【思考题】
• 1．为何要同时测定蛋白280nm和 260nm处的光吸收值？
实验三
（一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化
⑵ 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再 逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。 静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟 （注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖 子盖好）。倾上清液（上清中主要含α、β球 蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。
2.脱盐：
⑴ 装柱：将制好的葡
（1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素
①电荷(同种电荷相斥）
++
②水化膜（隔离） + Pr +
++
中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋 白质沉淀。
+ +
+ Pr +
++
中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的 水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入 蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋 白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶 解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
（2）盐析的影响因素
蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH 值、温度等。
本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液 中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在 33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。
2.层析：
待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相） 时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及 亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配， 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。
实 验二
紫外分光光度法测定蛋白质含量
【目的要求】 • ①了解分光光度法的基本原理； • ②能较熟练使用紫外分光光度计。
• 【实验器材】 • 1．紫外分光光度计。 • 2．微量加样器。 • 3．蛋白标准液（1mg/ml）。
【方法步骤】
• 1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏 定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓 度为1mg/ml的蛋白质溶液。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
• 实 验一、 双缩脲法测定蛋白质含量 • 实 验二 、紫外分光光度法测定蛋白质含量 • 实 验三 、血清γ-球蛋白的分离与纯化 • 实 验四、碱性磷酸酶Km值测定 • 实 验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响 • 实 验六、 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析 • 实 验七、 SGPT活性测定 • 实 验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶 • 实 验九 、RNA的分离与鉴定 • 实 验十 、DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质 • 实 验十一、 质粒的提取与鉴定
3.检测分离效果
（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。
（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与 其呈现红色或紫红色。
【实验操作】
1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混 匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边 摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10 分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋 白）。
样品管
—— 0.1 —— 5.0
空白管
—— —— 0.1 5.0
• 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用 540nm比色，以空白管调零点，读取各管光 密度值。
【注意事项】
• 1．正确使用微量加样器。 • 2．取液要准确。 • 3. 做好标记，不要将试管号弄混。
【思考题】
• 1．分光光度计的使用及计算原理。
实验一
双缩脲法测定蛋白质含量
【目的要求】 • 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。
• 【实验器材】
• 中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻 度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计
【方法步骤】
• 取中试管3支，按下表操作。
试剂（ml） 标准管
蛋白质标准 待测液 蒸馏水 双缩脲试剂
0.1 —— —— 5.0
注意：装柱要均匀，不要有气 泡和分层，凝胶面要平整
（2）加样：
向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴， 用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸 出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶表面。 待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用 乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部 分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至 洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表 面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至 凝胶面以下。
• 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释 成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混 匀，按上述方法测其吸光度。
【结果与分析】
• 1．根据标准曲线查出蛋wenku.baidu.com质浓度。
• 2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适 当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm 处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质 浓度。
【实验目的】
1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法 和原理；
2．熟悉盐析和层析的基本操作； 3． 掌握离心机的正确使用方法。
【仪器试剂】
试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、 层析柱、反应板；血清、PBS液、葡 聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸 铵溶液。
【实验原理 】 1.盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。
• 2．标准曲线的制作：取试管6只，按下表操作
管号 1
2
3
4
5
6
蛋白标准 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
液（ml）
生理盐水
（ml） 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0
• 混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光 径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光 度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白 质的浓度为横坐标绘制标准曲线。
（3）收集：
加样同时可进行收集，每管收集1ml。 收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶 和尼龙布等。
⑷ 检测：准备反应板两块。将12管收集液 各取1 滴分别放入反应板的12个凹孔。一 块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+ 者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无 呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内 加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。
• 如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度 （mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。
【注意事项】
• 1．加量要准确。 • 2．比色皿的正确应用。 • 3．结果重复3次，取平均值。
【思考题】
• 1．为何要同时测定蛋白280nm和 260nm处的光吸收值？
实验三
（一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化
⑵ 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再 逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。 静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟 （注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖 子盖好）。倾上清液（上清中主要含α、β球 蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。
2.脱盐：
⑴ 装柱：将制好的葡
（1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素
①电荷(同种电荷相斥）
++
②水化膜（隔离） + Pr +
++
中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋 白质沉淀。
+ +
+ Pr +
++
中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的 水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入 蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋 白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶 解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
（2）盐析的影响因素
蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH 值、温度等。
本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液 中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在 33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。
2.层析：
待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相） 时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及 亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配， 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。
实 验二
紫外分光光度法测定蛋白质含量
【目的要求】 • ①了解分光光度法的基本原理； • ②能较熟练使用紫外分光光度计。
• 【实验器材】 • 1．紫外分光光度计。 • 2．微量加样器。 • 3．蛋白标准液（1mg/ml）。
【方法步骤】
• 1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏 定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓 度为1mg/ml的蛋白质溶液。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
• 实 验一、 双缩脲法测定蛋白质含量 • 实 验二 、紫外分光光度法测定蛋白质含量 • 实 验三 、血清γ-球蛋白的分离与纯化 • 实 验四、碱性磷酸酶Km值测定 • 实 验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响 • 实 验六、 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析 • 实 验七、 SGPT活性测定 • 实 验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶 • 实 验九 、RNA的分离与鉴定 • 实 验十 、DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质 • 实 验十一、 质粒的提取与鉴定
3.检测分离效果
（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。
（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与 其呈现红色或紫红色。
【实验操作】
1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混 匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边 摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10 分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋 白）。
样品管
—— 0.1 —— 5.0
空白管
—— —— 0.1 5.0
• 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用 540nm比色，以空白管调零点，读取各管光 密度值。
【注意事项】
• 1．正确使用微量加样器。 • 2．取液要准确。 • 3. 做好标记，不要将试管号弄混。
【思考题】
• 1．分光光度计的使用及计算原理。
实验一
双缩脲法测定蛋白质含量
【目的要求】 • 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。
• 【实验器材】
• 中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻 度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计
【方法步骤】
• 取中试管3支，按下表操作。
试剂（ml） 标准管
蛋白质标准 待测液 蒸馏水 双缩脲试剂
0.1 —— —— 5.0