酶活性测定的基本知识(精)
酶活性的测定原理
酶活性的测定原理
酶活性是指单位时间内酶所催化的底物转化的速率。
测定酶活性的原理主要基于酶和底物之间的反应，通常采用比色法、发光法、电化学法等不同技术来测量产物的生成量。
一种常用的测定酶活性的方法是比色法，该方法主要通过测量底物转化后所产生的色素的强度或吸收率来反映酶活性的大小。
具体操作步骤如下：
1. 首先，准备好所需的实验试剂和设备，包括底物、酶溶液、缓冲液、比色剂等。
2. 将酶溶液加入适当的量的缓冲液中，以调节pH值和酶的浓度。
此步骤有助于提供适宜的反应环境，以发挥酶的最佳催化效果。
3. 在试管中加入适量的底物溶液。
4. 立即加入酶溶液，并立即开始计时。
为了确保测量的准确性和可比性，要确保每个实验条件下反应时间一致。
5. 在一定时间内（通常为几分钟或数十分钟），停止反应。
这可以通过加入酶活性停止剂、改变反应条件或其他合适的方法来实现。
6. 加入比色剂，使产物产生明显的颜色。
比色剂的选择要根据具体试剂和底物的特性来进行，以保证在所使用的检测设备
（如分光光度计）的波长范围内有明显的差异。
7. 使用合适的仪器（如分光光度计）测量产生的色素的吸光度或强度。
根据吸光度或强度的变化，可以通过对比标准曲线或对照组的结果，计算出酶活性的数据。
需要注意的是，在测定酶活性时，实验条件的控制非常重要。
包括温度、pH值、底物浓度和酶浓度等因素的选择和控制，都会对测定结果产生影响。
因此，在进行酶活性测定时，应该对这些因素进行合理的控制和调节，以提高实验结果的准确性和可比性。
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
酶的活性测定实验
酶的活性测定实验酶是一类具有生物催化作用的蛋白质，广泛存在于生物体内。
通过测定酶的活性，可以更好地了解酶在生物体内的功能和作用。
本文将介绍一种常用的酶活性测定实验方法。
一、实验目的本实验旨在通过测定酶的活性，了解酶的催化作用和酶动力学特性。
二、实验原理本实验采用间接法测定酶的活性。
在反应过程中，酶与底物反应生成产物，产物的形成量与酶的活性呈正相关关系。
三、实验材料和仪器1. 酶溶液（待测）：使用酶提取物或商用酶溶液。
2. 底物溶液：适当浓度的底物溶液，可以根据实验需要选择不同的底物。
3. 反应液：含有酶溶液、底物溶液和缓冲溶液的混合液。
4. 停反液：酸性或碱性溶液，用于停止酶的活性。
5. 试管或微量离心管：用于容纳反应液和停反液。
6. 恒温水浴：用于控制反应的温度。
7. 分光光度计：用于测定反应液的吸光度变化。
四、实验步骤1. 准备反应液：根据实验需要，将适量的酶溶液、底物溶液和缓冲液按一定比例混合，制备反应液。
2. 设定反应温度：使用恒温水浴，将反应液恒温至所需的实验温度。
3. 开始实验：将预先准备好的反应液加入试管或微量离心管中，立即放入预热恒温水浴中开始反应。
4. 反应时间控制：根据酶活性的快慢，控制反应时间，一般可选择1-10分钟不等。
5. 停反应：反应结束后，立即加入适量的停反液，停止酶的活性。
6. 吸光度测定：将停止反应后的混合液取出一部分，使用分光光度计测定其在特定波长下的吸光度。
五、数据记录与分析1. 记录吸光度测定结果：将吸光度测定的结果记录下来，分别对应不同的测定时间点。
2. 绘制反应曲线：将吸光度与测定时间点进行绘制，得到反应曲线。
3. 计算反应速率：根据反应曲线的斜率，计算反应速率。
4. 测定酶活性：根据反应速率的计算结果，测定酶的活性，一般以单位时间内产生单位底物的量表示。
六、实验注意事项1. 实验过程中要严格控制温度，避免温度的变化对实验结果的影响。
2. 底物浓度和反应时间要根据实验需要进行适当选择，过高或过低的浓度和时间都会对实验结果产生影响。
酶活测定原理
酶活测定原理酶活测定是通过测定酶反应产物生成的物质量或反应速率来确定酶活性的一种方法。
这种测试被广泛应用于生物、医学、环境和食品科学领域。
本文将重点介绍酶活测定的原理和方法。
一、酶的定义和分类酶是一类具有催化生物反应能力的蛋白质，在生物体内担任调节代谢过程的重要角色。
酶的活性被认为是其特异性、选择性和效率的关键因素。
酶根据其催化反应类型，可以分为六类：1. 氧化还原酶：例如过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，可以将还原剂氧化成相应的氧化物。
2. 转移酶：例如乙醛酸酯酶和谷氨酰胺转移酶，可以将一个基团从一个分子转移到另一个分子。
3. 加水酶：例如酯酶和葡萄糖苷酶，可以加入水分子切断化学键。
4. 合成酶：例如DNA聚合酶和RNA聚合酶，可以将单体结合成聚合物。
5. 裂解酶：例如蛋白酶和纤维蛋白溶解酶，可以降解大分子化合物。
6. 引导酶：例如酰基载体蛋白，可以在代谢过程中向该蛋白基团上结合或从该基团上解离。
二、酶活测定的原理酶活性通常通过测量酶反应的速率来评估。
酶反应速率与底物浓度、酶浓度、反应温度和pH值等条件有关。
在酶活测定中，这些条件必须被控制和标准化。
测量酶活性可以通过直接测量酶反应产物生成的量或测量反应底物消耗的量来进行。
下面介绍常用的酶活测定方法。
1. 进行光学密度测定酶活测定可以通过光学测量来实现。
在酯类水解反应中，酶催化酯水解为醇和羧酸。
在这种反应中，测量分离的醇透过率或吸光度变化，可以计算出相应的反应产物含量。
这种方法可以适用于其他酶反应，例如测定酒精脱氢酶催化的乙醛氧化反应。
2. 进行电化学测定另一种常用的酶活测定方法是电动势测定。
该方法用于测量电位差的变化以检测酶催化反应过程中电子的流动。
在氧化还原酶催化的反应中，测量体系中的电位差可以告诉我们酶的活性程度。
3. 进行放射性测定有些酶活性测定需要使用放射性示踪剂。
在DNA聚合酶催化下进行DNA复制实验中，可以使用放射性示踪剂来测量酶反应产物的数量。
酶活性的测定(青苗教育)
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技能教育
过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名 触酶(Catalase，CAT)，是一类以铁卟琳为 辅基的结合酶，由4个亚基组成，分子量为 240 000。存在于动植物组织与细胞中的氧 化还原酶类，它专一性地将细胞代谢产生 的过氧化氢分解成H2O和02，避免了H202在体 内积累，从而可维持体内正常的活性氧水 平。是最早发现的与种子活力有关的氧化 酶类之一.
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测定茶树鲜叶APX活性的最佳条件
PVPP的加入量为鲜叶重的1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
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注意事项：
（1）由于测定反应是通过测定反应底物AsA的降 低来计算APX活性，因此所加的酶量一般不宜过大 ，应使加液量控制在60s内，使产生的A290光值下 降呈良好的线性关系。
反应液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/L AsA；0.1 mmol/L EDTA。
在三个比色皿中各加入20µL鲜叶APX粗酶液， 再加入3mL反应液；1号比色皿中不加AsA和 H吸2O光2启值动的反变应化；X。每室10温s连下续每记一录分室钟温氧下化290nm 1µmolAsA的酶量作为一个酶活性单位（U）。
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.SOD活性测定：
将样液加入到Tris缓冲溶液中，其余步骤同自 氧化速率测定方法。 活力单位定义：将一定条 件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量 定义为一个单位（u）。
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过氧化物酶(ＰＯＤ)活性的测定 —愈创木酚法
一、实验原理
过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反 应，产物为醌类化合物。
实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。 在此酶存在下，H2O2 将愈创木酚氧化生成 茶褐色产物。此产物在470nm 有最大光吸 收，故可通过470nm处的吸光度变化测定过 氧化物酶的活性。
10-酶活性测定
酶活性测定---介绍酶活力、比活力的概念以及测定方法⏹酶活力（enzyme activity)●酶活力与酶反应速度酶活力指酶催化一定化学反应的能力，以测出的酶促反应速度表示酶的活力即测定单位时间、单位体积底物减少量或产物增加量来表示测定初速度，测定产物增加量[P]0 X 时间TVVX产物浓度产物浓度变化曲线反应初速度V o●酶的活力单位（U activity unit)酶活力单位（U）的定义：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物的酶量。
国际单位：最适条件下，在1分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1个单位，即1IU=1μm/minKcat单位：最适条件每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量，定为1个Kcat单位.Kcat单位与IU单位之间的换算关系如下：1Kcat=60×106IU1IU=1/60uKcat=16.7nKcatBUT………•限制性核酸内切酶3种定义•用粘度法测活性：30℃，1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。
•转化率法：5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。
•凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。
⏹酶的比活力（specific activity)●每毫克蛋白质或每毫升蛋白质所含酶的活力单位数，用单位/毫克蛋白或单位/毫升来表示，n U/mg或n U/ml●代表酶的纯度:比活力越大纯度越高●可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力，酶产品质量评价中常使用的指标⏹酶活力的测定方法测定酶活力就是测定产物的增加或底物的减少，根据产物或底物的物理或化学性质来决定具体酶催反应的测定方法●分光光度法：利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应中反应进行的情况，酶活力测定中最重要的方法。
优点：简便、节省时间和样品增加底物浓度213456780 2 4 6 8底物(m mole)产物80604020S+E↓P(在一定时间里)●荧光法：根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定优点是灵敏度高，缺点是易受其它物质的干扰。
酶活性的测定
低温酶学
五、pH 对酶反应的影响
最适pH时的酶 最适 时的酶 活力最大
•最适 因酶而异， 最适pH因酶而异 最适 因酶而异， 多数酶在7.0左右 多数酶在 左右 •是酶的特性之一 是酶的特性之一
连续监测法所需仪器
仪器 722s型分光光度计、电子分析天平、 高速冷冻离心机、微量移液器等
过氧化物酶活力的测定
操作步骤
一、酶液提取
分别精确 分别精确称取不同部位的植物样品0.2g左右，加入预冷的酶提取缓冲液约 精确 5ml，于研钵中研磨成匀浆（冰浴）,匀浆转入2支离心管，用少量(约1ml)缓 冲液冲洗研钵一并转入,托盘天平平衡后于8000转/分钟离心15分钟（低温）。 将上清液倒入刻度试管，定容至10ml，插入冰浴待测。
酶活性单位(U 酶活性单位 )
按照国际酶学会议 的规定，1个酶活 力单位是指在25℃ 、测量的最适条件 （指最适pH、温 度等）下，1分钟 内能引起1微摩尔 底物转化的酶量。
术语酶活力指的是 溶液或组织提取液 中总的酶单位数。
在酶的纯化过程中 常用到另一个术语 （specific activity） ）
比活
是指每毫克蛋白含有的酶单位数。 是指每毫克蛋白含有的酶单位数。随着 毫克蛋白含有的酶单位数 酶纯化的进行，比活会越来越高， 酶纯化的进行，比活会越来越高，当酶 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 所以比活是酶纯化程度的指标 指标。 所以比活是酶纯化程度的指标。
双分子反应、 双分子反应、一级反应
酶促反应的动力学方程式
1、米氏方程 、
1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 年 和 提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－ 物浓度关系的数学方程式 ，即米 － 曼氏方程 简称米氏方程(Michaelis equation)。 式，简称米氏方程 。
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习复习和练习1。
酶的基本理论知识1。
酶浓度和酶反应速度之间有什么关系？2、底物浓度和酶促反应速率之间的定量关系是什么？3.影响酶促反应速度的主要因素是什么？4、Km和Vm的意义及其在临床酶活性测定中的应用和意义二、酶活测定的基本知识1，酶活的概念以及如何表达酶活的单位2，目前酶活的单位有-？3.解释酶活性的国际单位和卡达尔的概念，并比较它们之间的关系？4.酶活单位的计算:几种类型的计算公式需要理解和熟练的应用。
1)通用公式2)常用单位的计算公式(确定产品生成类别的计算公式；用于确定底物消耗的计算公式)3)**连续监测方法根据摩尔吸收率计算酶活性浓度；**连续监测法(全自动生化仪通常用k表示)f因子值的计算及应用？三、酶活的测定方法1，酶活测定的基本原则是什么？2，酶反应时间过程曲线有三个周期-，-，-酶活性测定是在-周期内，这个周期的反应速度不受-连续监测法的影响-4分为-直接法有哪些类型？5，什么是酶偶联反应？写下酶偶联反应的基本模式？要测试的酶是什么，辅助酶和指示酶？6.什么是工具酶？当酶在临床生化试验中用作工具时，哪两种指标系统通常可用于酶活性测定或代谢物浓度(底物)测定？什么是-Trinder反应？Trinder反应的主要缺点或影响因素是什么？7，什么是同工酶？同工酶分析的共同原则是什么？同工酶检测的临床意义是什么？举个例子？8，酶活性的测定条件和影响因素是什么？9，从几种酶活性测定(如AMY、ALT、LD、ALP|)的实验操作，讨论了酶活性测定中应注意的问题。
10。
影响血清酶的生理变化是什么？11、酶活性测定、样品采集、处理、储存和样品试剂的比例有什么要求？四.体液酶的测定:1。
临床诊断中常用的血浆酶是什么？用于帮助诊断心肌损伤、肝病、胰腺疾病、骨骼肌、前列腺疾病等的常用血清酶是什么？常用的临床诊断酶谱是什么？2.分析和总结测定血清酶活性的方法学原理，并请总结有哪些主要反应基础3.写出AMS和ALP(化学比色法，连续监测法)和ALT、AST、GGT、LDH和CK酶测定法(连续监测法)的反应原理、主要试剂成分和功能？影响结果准确性的因素有哪些？评价低密度脂蛋白反应和低密度脂蛋白反应试剂盒的优缺点？4、血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、GGT、AMS、CK、LD等酶测定的临床意义？5，选择题:A 1，K m指A底物浓度b酶浓度c活化剂浓度D温度e抑制剂浓度D 2。
酶活测定 原理
酶活测定原理
酶活测定是一种常用的实验方法，用于测定酶在一定条件下的活性。
酶活性是指酶在特定条件下催化底物转化的速率，是衡量酶功能的重要指标。
酶活测定的原理基于酶与其底物之间的专一性反应。
当酶与底物结合形成酶-底物复合物时，酶会使底物发生化学反应，产生产物。
产物的生成量与酶活性成正比，可以作为测定酶活性的指标。
常见的酶活测定方法包括光度法、荧光法、融合法、电化学法等。
其中，光度法是最常用的方法之一。
该方法通过测量底物的某种性质的变化来间接测定酶活性。
例如，可以根据底物的吸光度变化来测定酶活性。
在酶活测定实验中，常使用专一底物来与特定的酶反应，以增强实验的专一性和敏感性。
同时，为了控制实验条件，通常需要对温度、pH值等参数进行调整，以确保实验结果的准确性和可比性。
酶活测定在许多生物学和生物化学研究中起到了重要的作用。
通过测定酶的活性，可以评估酶的功能状态、酶活性的变化以及酶与底物之间的相互作用。
这对于深入理解生物过程、研究酶的功能以及开发新药物等方面具有重要意义。
酶活性测定方法原理
酶活性测定方法原理
酶活性测定方法是用来测量酶的催化活性的方法，其原理基于酶催化反应速率与酶活性之间的关系。
酶活性是指酶催化单位时间内转化底物的量，通常以单位时间内生成的产物的浓度变化率来表示。
酶活性的测定方法可以分为直接测定和间接测定两种。
直接测定方法包括光度法、荧光法和放射性测定法等。
其中，光度法是最常用的方法之一。
其基本原理是通过测量与酶催化反应相关的光学性质的变化来确定酶的活性。
这些光学性质可以是波长、吸光度、发光强度等。
间接测定方法主要是通过测定酶催化反应过程中与底物转化相关的反应产物的生成量来间接得到酶活性。
常见的方法有pH 法、电位滴定法和色谱法等。
例如，pH法是通过测定与底物转化相关的酶催化反应产生的H+或OH-离子生成量来确定酶的活性。
总的来说，酶活性测定方法的原理是根据酶催化反应速率与酶活性之间的关系，通过测定与底物转化相关的反应产物的生成量或与酶催化反应相关的光学性质的变化来确定酶的活性。
酶活性测定技术的使用教程
酶活性测定技术的使用教程简介：酶活性是指单位时间内酶能够催化的底物转化的数量，是评估酶活性及其效率的重要指标。
酶活性的测定对于生物学、医学和食品科学等领域具有重要意义。
本篇文章将为您介绍酶活性测定技术的使用教程，帮助您了解如何准确测定酶活性并获得可靠的实验结果。
一、酶活性测定原理酶活性测定的原理是通过测定单位时间内酶所催化的底物转化速率来评估酶的催化效率。
常见的酶活性测定方法包括色谱法、光谱法、比色法和电化学法等。
选择合适的方法需要根据实验的具体目的和所研究的酶的特性来决定。
二、酶活性测定步骤1. 样品制备：首先根据实验目的选择合适的样品，可以是纯酶、酶提取液或含酶的生物样品。
按照实验要求将样品进行预处理，例如将样品离心、稀释或者浓缩等。
2. 酶活性测定方法选择：根据样品和实验目的的不同，选择合适的酶活性测定方法。
常用方法包括比色法、光谱法和电化学法。
3. 实验操作：根据所选择的酶活性测定方法，进行相应的实验操作。
通常包括以下几个步骤：a. 准备试剂并调整反应体系：根据实验所需，准备好所需的试剂，并按照比例将试剂加入到反应体系中。
b. 控制实验条件：因为酶活性常受温度、pH值和离子浓度等因素的影响，所以在实验过程中需要控制好这些条件以确保准确的结果。
c. 反应时间和反应温度的优化：根据所研究的酶的特性，通过调整反应时间和反应温度来优化实验条件。
d. 反应停止和数据记录：根据所使用的方法，选择合适的方法来停止反应，并记录数据。
4. 数据分析：根据实验所得的数据，进行数据分析和结果解读。
根据所使用的酶活性测定方法，可以得到对应的活性值。
常用的酶活性单位有单位时间里转化底物的数量（例如单位时间里转化的亚硝酸盐浓度变化量）或者特定反应物的生成速率等。
5. 结果验证：通过对多组样品的测定，可以进行结果验证。
重复实验或者使用多个不同方法进行测定，可以提高结果的可靠性。
同时，设立对照组和空白组，可以进一步确认实验结果的准确性。
酶活性的测定PPT课件
照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反 应后，再加底物予以抵销。
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酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDHΒιβλιοθήκη 山梨醇脱氢酶SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺
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米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
7
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以 防止底物被分解或变质 • 4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有 酶的抑制物 • 5、使酶活性测定在线性期内进行
酶活性的知识点总结
酶活性的知识点总结一、酶活性相关概念解析1. 酶的特点酶是一类生物催化剂，通常是特定的蛋白质，可以加速生物体内化学反应的速率，但不改变反应的平衡。
酶与底物通过特异性的结合形成酶底物复合物，从而降低反应的活化能，使反应更容易发生。
2. 酶活性的定义酶活性是指酶在特定条件下催化反应的速率，通常用单位时间内酶所催化的底物转化量来表示。
酶活性受到多种因素的影响，如温度、pH值、离子强度、底物浓度等。
3. 酶活性的测定酶活性的测定通常使用底物与产物的变化速率来表示，常见的方法有光度法、比色法、流式细胞术等。
通过测定酶在不同条件下的活性，可以揭示酶与底物的亲和力和稳定性，为酶的应用提供重要参考。
二、影响酶活性的因素1. 温度温度是影响酶活性的重要因素之一。
一般来说，温度升高会使酶活性增加，但超过酶的适宜温度范围后，酶会失活。
这是因为温度升高会增加底物与酶的碰撞频率和能量，促进酶底物复合物的形成，打破非共价键，从而促进反应的进行。
2. pH值pH值是影响酶活性的另一个重要因素。
不同的酶对pH值的适应范围各不相同，一般来说，大部分酶在特定的pH范围内能够保持较高的活性。
过高或过低的pH值会改变酶的结构和电荷状态，从而影响酶与底物的结合和活性。
3. 金属离子许多酶活性依赖于金属离子的存在。
金属离子可以作为辅因子结合在酶分子上，参与催化过程。
不同的酶对金属离子的依赖性和选择性各有不同。
4. 底物浓度底物浓度对酶活性也有显著影响。
一般来说，随着底物浓度的增加，酶催化速率也会增加，直到酶达到饱和状态。
因此，底物浓度对于反应速率的调控具有重要意义。
5. 抑制剂抑制剂是一类能够抑制酶活性的物质，可以分为竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂和混合型抑制剂。
抑制剂能够与酶结合，并改变酶的活性中心结构，从而降低酶的催化活性。
三、酶活性的应用1. 医学诊断许多疾病都会导致酶活性的改变，因此测定血清中酶活性可以成为一些疾病的诊断依据，例如心肌梗死、肝功能异常等。
酶活性的测定(1)
酶活性的测定1 实验背景（1）酶活性的定义酶活性（enzyme activity）也称酶活力，指酶催化指定化学反应的能力酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的化学反应的速率来表示，反应速率愈快，就表明酶活力愈高酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示，实际酶活性测定中一般以测定产物的增加量为准012345678910111213141551015202530时间/min产物的量酶活性＝反应初速率＝产物量的变化/时间/ m m o l /LpNPP （磷酸对硝基苯酚）pNP （对硝基苯酚）＋Pi碱性磷酸酶（2）酶活性的测定方法方法原理优点缺点分光光度法底物、产物或指示剂在紫外或可见光部分吸光度不同操作简便，节省时间和样品，可用于动力学监测灵敏度相对较低荧光法底物、产物的荧光性质有差别灵敏度高易受其它物质（特别是蛋白质）干扰同位素测定法底物用放射性同位素标记灵敏度高操作复杂，代价昂贵电化学方法用pH计跟踪H+浓度的变化操作比较简便仅适用于有H+生成或消耗的反应碱性磷酸酶测活原理pNPP （磷酸对硝基苯酚）pNP （对硝基苯酚）＋PiA 410= ε（λ）C LpNP 的摩尔消光系数ε（λ）为17500 mol -1·L·cm -1117500A C 410⨯=碱性磷酸酶肌酸激酶测活原理肌酸＋MgATP2-MgADP-+ 磷酸肌酸+ H+用百里酚蓝作为pH指示剂，测定597 nm吸光度的变化，用于计算酶活性[H+]∆A597= 1.3 ∆[H+]将酶加入底物溶液中，快速混合，开始反应 反应一段时间后，加入反应终止液，终止反应使用分光光度计测定产物的浓度，计算酶活性①终止法测定碱性磷酸酶的活性123456789101112131415051015202530时间/min产物的量/ m m o l /L●计算酶样品的活力单位数（U，activity unit）酶活力单位是酶活力大小的一种衡量单位按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适pH、温度25℃等）下，1分钟内能催化1μmol底物转化为产物所需的酶量1 IU=1 μmol/min碱性磷酸酶活力国际单位规定：以pNPP 为底物，在pH 为8.5，30o C 下每分钟产生1μmol pNP 所需要的酶量为一个活力单位1011750010004.0A 6410⨯⨯⨯⨯=位数碱性磷酸酶活力国际单管号测活液AKP 30o C反应10min终止液A 410360 μL40 μL3.6 mLn V ⨯⨯04.0)ml (V ：碱性磷酸酶样品的总体积；n ：酶样品的稀释倍数碱性磷酸酶活力国际单位数●计算酶样品的比活力酶的比活力指每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位数比活力= 总活力U/总蛋白mg比活力是酶纯化程度的指标04.0c 101 1750010004.0A6 410⨯⨯⨯⨯⨯=碱性磷酸酶比活力C：碱性磷酸酶样品的浓度（mg/mL）碱性磷酸酶比活力②连续法测定碱性磷酸酶的活性将适量酶加入底物溶液中，快速混合将酶与底物的混合液迅速转移入比色杯中，放入分光光度计 利用分光光度计连续测定吸光度的变化利用吸光度变化的动力学曲线与 A值计算酶活力连续法测定碱性磷酸酶的活性11750010002.0A 位数碱性磷酸酶活力国际单6410⨯⨯⨯∆=碱性磷酸酶活力国际单位数测活液AKP 30o C 连续反应∆A 4102 mL 22 μL2 实验试剂（1）底物溶液（测活液）pH 8.5100 mL 50 mmol/L Tris-HCl0.2 mg/mL BSA10 mmol/L pNPP2 mmol/L MgAc2（2）酶稀释液pH 8.5100 mL50 mmol/L Tris-HCl0.2 mg/mL BSA2 mmol/L MgAc22 实验试剂（3）测活终止液0.5 mol/L Na3PO410 mmol/L EDTA3 实验操作1）准备4个玻璃试管，放在试管架上，用微量移液器将0.2mL酶稀释液加入1号试管中，然后将0.2mL酶溶液加入1号试管，用旋涡混合器混合；接下来，将0.2mL 酶稀释液加入2号试管，从1号试管取出0.2mL液体样品，加入2号试管，用旋涡混合器混合；将0.2mL酶稀释液加入3号试管，从2号试管取出0.2mL液体样品，加入3号试管，用旋涡混合器混合；将0.2mL酶稀释液加入4号试管，从3号试管取出0.2 mL液体样品，加入4号试管，用旋涡混合器混合。
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(五) 酶促反应影响因素及反应条件的选择
• 影响酶促反应的因素主要有底物浓度、酶浓度、温度、pH、 •
• • •
抑制剂、辅因子和激活剂等 1.底物浓度 当底物浓度[S]>>Km，米-曼氏方程中的Km 可以忽略不计，此时V≌Vmax，反应速度达最大速度，反 应速度与酶浓度成正比。根据米-曼氏方程，一般酶活性测 定时底物浓度最好为Km的10~20倍，初速度可达最大速 度的90%~95%。 2.酶浓度 按照中间产物学说，只有[S]>[E]时，酶才能被 底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。 3.温度 多数酶的最适温度在37~40℃，高于或低于最适温 度，酶活性都降低。 4.pH pH过高或过低均可导致酶活性下降。一般来说，血 清中大多数酶最适pH在6.5～8.0之间。
从酶促反应时间进程曲线可以看出，酶促反应的各期具有以下 特点：
• 1.延滞期 对单一酶促反应而言，在过量的底物存在下，底
物与酶结合启动酶促反应。
• 2.线性期 指酶促反应速度达到并保持恒定速度进行反应的
时期。此时，反应速度不受底物浓度的影响，又称零级反 应期。此期酶活性与酶促反应速度成正比。
• 3.非线性期 随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，
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(三)Vmax的应用
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定义 ： Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。 应用：
Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子 酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反 应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的 转化率：
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3、酶活性单位的计算
步骤：
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明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位 定义确定物质量、体积和时间的单位，
运用公式进行计算。
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计算公式:
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产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×—————— 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml
2、酶活性单位
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定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度 时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标 准。
惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。
国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下， 每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L 。 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量，1Katal=60×106IU。
酶促反应速度明显下降，偏离线性期而进入非线性期。
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酶量的测定：
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通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准 确测定酶量，应使酶浓度（〔E〕）与酶促反应速度 成正比，即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。 能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速 度，即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反 应速度才能准确代表酶活性。 酶促反应初速度 酶活性 酶的含量
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5、酶促反应底物动力学
中间产物学说：
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酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催 化底物反应生成产物。E + S ES → E + P
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米-曼氏方程：
以系统编号。数字前冠以EC，数字之间用黑点隔开。第一 个数字表示酶的类别，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚 类，第四个表示酶的编号序数。 • 如：乳酸脱氢酶属于第1大类，第1亚类，第1亚-亚类，在 第1亚-亚类中的编号为27，故此酶的专有编号为 EC1.1.127
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分光光度法测定的公式：
（A测定 – A对照）·V总·106 每单位规定的保温时间 ·L·V标本 实际保温时间
酶单位/升 = —————————×————————
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4、酶促反应进程
酶促反应进程曲线
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职业教育医学检验技术专业教学资源库
永州职业技术学院 欧陵斌
酶活性测定的基本知识
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第一节
酶活性测定的基本知识
酶是一种生物催化剂，其化学本质是 蛋白质。它在体内含量极微，每ml仅为 pg水平，要直接测定其绝对量是十分困 难的，目前是根据其催化反应速度来定量， 称为相对定量法。
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4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的比率 根据米-曼氏方程可以计算 5.设计适宜的底物浓度
酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶 活性，一般要求初速度达到最大速度的90%～95%、底物 消耗率为1%～5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不 致于使底物浓度过高而造成浪费。
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（一）酶的结构和分类
单纯酶
酶ห้องสมุดไป่ตู้
结合酶
辅酶
辅基
分类：根据酶所催化的反应类型将酶分为氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶六大类。
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（二）酶的系统命名
• 酶的系统命名法(又称EC命名法)：即每种酶用四个数字加
类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。
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表7-1
酶
某些酶的Km值
底物 Km(mmol/L)
0.017 0.05 1.5 4.0 9.0 25 28 108
乳酸脱氢酶 己糖激酶
-半乳糖苷酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 蔗糖酶 糜蛋白酶
TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol）
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(四)Km和Vmax的测定 1．Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法 1 Km +〔S〕 Km 1 1 —— = ————— = ——— · —— + ——— v Vmax〔S〕 Vmax 〔S〕 Vmax
（三）、酶活性的概念
1、
酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位 v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt。
时间内底物的减少量或产物的生成量。
底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为v
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的 生成量为好。
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v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
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（二）Km值的应用
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1.鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与
酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种
丙酮酸 D-葡萄糖 D-果糖 D-乳糖 H2CO3 H2O2 蔗糖 甘氨酰酪氨酰甘氨酸
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2.反映酶与底物的亲合力
Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。 3.选择酶的最适底物
Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底 物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物， 使酶促反应容易进行，并节省底物用量。
Vmax〔S〕 v = ————— 〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
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（一）米氏常数的定义 由米-曼氏方程可以导出： （Vmax-v）〔S〕 Km = ———————