6新城疫抗体测定-比赛规程
新城疫抗体水平检测
新城疫抗体水平检测文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开 一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。
2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。
二、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体 三、实验原理1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。
2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。
病毒颗粒红细胞四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤 （一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。
1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。
（二）10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。
2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。
3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、2-6摄氏度储存，备用。
（三）血凝试验（HA)1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul 生理盐水抗体抗原2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。
新城疫抗体检测
新城疫的抗体检测某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的实验称血球凝集试验，以此来推断被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制，即血球凝集抑制实验（HI），通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
一目的意义1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低）3流行病学调查二试验仪器与试剂1试验仪器离心机、离心管两支、50ml量筒一个、V型微量反应板、微量加样器（移液器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml吸管1支、胶头滴管两支、微量振荡器、电热恒温培养箱、托盘天平。
2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5、H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。
三方法1病毒的血凝试验1.1 3.8%柠檬酸钠抗凝剂的配制：用托盘天平称取柠檬酸钠3.8克溶于100ml蒸馏水或纯净水中，摇匀使其充分溶解即可，有条件的可121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后置4℃冰箱中保存备用。
1.2 1%鸡红细胞制备过程：事先用5ml（或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为所需血量的1/5）,从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4毫升血液,以2000转每分钟，离心5分钟，吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。
然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10倍）洗红细胞，离心5分钟，弃去上清液，如此反复洗3-5次，直至上清液透明清亮为止，最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度，然后置4℃冰箱备用（一般可保存3天）。
1.3 红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）：（1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板，用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水，每孔25微升，直至加到第十五孔（第一列12孔，第二列3孔）。
新城疫抗体测定的规范操作
新城疫抗体测定的规范操作作者：向双云，周珍辉来源：《江西畜牧兽医杂志》 2013年第2期向双云，周珍辉（北京农业职业学院，北京房山 102442）1 测定的器材及使用方法1.1 托盘天平托盘天平测量开始前，必须先将游码移到标尺左端的零刻度处，然后才开始调节平衡螺母，使天平平衡。
若将平衡螺母左右移至尽头天平仍不得平衡，则应检查原因，不能移动游码来达到平衡。
1.2 离心机离心机使用时离心管液体不能装得太满，对称放置的试样必须配平。
1.3 移液枪移液枪吸头装配时需将移液器垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可，切勿用移液器反复撞击吸头来上紧。
1.4 移液器移液器吸液时应垂直吸液，吸头尖端侵入液面3 mm以下，吸液时枪头应预润湿，然后再正式移液。
吸液可将按钮按到第一档吸液，释放按钮。
放液时先按下第一档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。
吸取的过程应该做到“慢吸快打”，在吸液时要慢、准，放液时对准后速度要快，可以避免打完后吸头下存留液体，保证加入的液体体积一致。
2 规范的采血方法采血前采血者先将注射器内吸入3.8%的枸橼酸钠。
采血时，一人将鸡侧卧保定，一人固定鸡的头部和脚；从侧翅膀采血，一手固定采血部分，一手采血；采血完毕后采血者一手将抗凝剂和血液轻轻摇匀，一手用干棉球按压采血部位止血。
采血部位最好从翅静脉丛刺入，比较容易采血成功且不容易淤血。
3 红细胞悬液的配制血液采集完毕需取下针头，把血液沿离心管的管壁缓慢注入离心管中，防止红细胞的破坏。
然后轻轻来回晃动离心管，使血液与抗凝剂充分混合，配平后置于离心机中开始离心。
离心完毕，应先选用5 mL的移液器吸取上面的液体，然后再选用1 mL或200 μL的移液器吸取，最好以画圈的方式吸取，比较容易把白细胞和血小板吸干净。
最后一次离心完毕，按照计算量用移液器从离心管底部吸取红细胞放入加好生理盐水的烧杯中，再反复回用生理盐水将移液器吸头里的红细胞洗下来，保证配制红细胞浓度的准确性。
新城疫抗体测定技术
2013动物疫病检测新技术暑期培训
结果判定（新城疫抗体测定）
在生理盐水对照孔出现正确结果（红细胞完全流下）的情况下，将反 应板倾斜，从背侧观察，正确判读被检血清、标准阳性血清和标准阴 性血清的HI效价，以nLog2方式报告结果，并填写结果报告单。
只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标 准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用 阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。
采血器或灭菌干净青霉素小瓶中凝固成斜面，室温下2-3 小时或4℃冰箱中过夜使血清析出，也可通过离心加快血 清析出。 血清为淡黄色透明液体。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
翅静脉采血
针头在静脉血管一侧倾斜刺 入皮肤，再与血管平行进针后刺 入血管，见有少量回血即可采集 血液，采血完成后马上用手压迫 止血。
3. 配制1%RBC悬液
根据红细胞的体积，计算所需生理盐水量，用所需生 理盐水将红细胞泥全部冲入小烧杯中，摇匀即可。
注意：摇匀时动作要轻柔，以防红细胞破碎或液体外溢。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
三、血凝试验（HA）
1．基本原理
血凝素 纤突
血凝素纤突 受体
RBC
血凝性病毒
有相应受体的红细胞
红细胞凝集（HA现象）
血凝素纤突
血凝素纤突受体 RBC RBC RBC RBC RBC
HA
血凝性病毒
RBC
RBC
有其受体的红细胞
红细胞凝集（HA现象） Ag、Ab不对应
血凝素纤突
v
v
RBC
HI
血凝性病毒 抗体
v RBC v
RBC
新城疫抗体水平检测
新城疫的血凝和血凝克制试验高若开一、实验目的1.掌握血凝和血凝克制试验的基来源理、操作方法和结果判断方法。
2.剖析血凝和血凝克制试验的影响要素，用以确立最正确免疫时间、判断免疫成效和协助疾病诊疗。
二、实验内容1.血凝试验 (HA) 检测新城疫抗原2.血凝克制试验 (HI) 检测新城疫抗体三、实验原理1.血凝试验（ HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝聚，这类凝聚红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反响。
病毒红颗细粒胞2.血凝克制试验（ HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这类抗体的量足以克制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不可以与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝聚现象就被克制，称为红细胞凝聚克制（HI ）反响，也称血凝克制反响。
抗原抗体I am late！四、实验资料离心计、恒温箱、冰箱、振荡器、 96 孔血凝版（ 5 块）、微量移液器（ 20-100 （若干）、洗耳球、离心试管、一般试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、微升可调）、吸液尖ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将 1 克柠檬酸钠用25 毫升生理盐水稀释备用。
1 毫升抗凝剂可用于收集9 毫升血液。
（二） 10%红细胞悬液的配制1、用注射器汲取 0.5 毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞 4.5 毫升。
2、 1500 转离心 5 分钟，吸弃上清液。
3、用 5-10 倍生理盐水 1500 转清洗 3 次，前两次 5 分钟，后一次10 分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管汲取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、 2-6 摄氏度储藏，备用。
（三）血凝试验（ HA)1.在血凝板上第一排的1－ 12 孔内各加入 50ul 生理盐水2.将系苗用生理盐水 5 毫升稀释，在第 1 孔内加入 50ul 病毒抗原，而后挨次倍比稀释至第11 孔，最后弃 50ul。
鸡新城疫抗体水平测定赛项理论竞赛试卷
全国职业院校技能大赛鸡新城疫抗体水平测定赛项理论竞赛试卷（一）工位号：考试时长：120分钟一、填空题（每空0.5分，共10分）1. 传染病的传播方式可分两大类：和。
2. 传染病流行的三个基本环节是、传播途径和。
3. 细菌的特殊结构包括、、和。
4. 病毒的复制过程包括、穿入、、、和五个阶段。
5.根据动物机体感染病原体后病程长短的不同，感染可以分为、、和。
6.当口蹄疫流行时，绵羊是口蹄疫病毒的储存器，是感染的放大器，是发病的指示器。
7. 抗原的性质包括__________和__________两个方面。
二、单项选择题（每小题1分，共10分）1. 国家对动物疫病实行的主要方针是（）。
A. 预防为主B. 加强检疫C. 监督管理D. 扑杀2. 鸭传染性浆膜炎的主要特征不包括（）。
A. 纤维素性心包炎B. 纤维素性肝周炎C. 纤维素性气囊炎D. 纤维素性肠炎3. 下列哪一条关于禽霍乱的表述是错误的？（）A. 病原为禽多杀性巴氏杆菌B. 产蛋鸡常发C. 肉髯肿胀，变青紫色D. 对水禽无致病性4. 关于病毒的特点，叙述错误的是（）A. 对抗生素敏感B. 能通过细菌滤器C. 增殖方式为复制D. 不能在人工培养基上生长5.细菌的运动器官是（）。
A. 荚膜B. 鞭毛C. 菌毛6.下列属于人工主动免疫的是（A.注射卵黄抗体获得的免疫C.通过胎盘获得的免疫7. 下列（ D.芽胞B. 患传染病康复后获得的免疫D.接种疫苗获得的免疫）属于中枢免疫器官。
A. 脾脏B. 胸腺C. 淋巴结D. 哈德尔氏腺8. 抗感染免疫的主力抗体为（ ）A. IgGB. IgMC. IgAD. IgE9. 对动物采取免疫接种的目的是（ ）A ．降低易感动物的易感性B ．控制传染源C ．切断传播途径D ．控制疫源地10. 牛结核病检疫是利用了（ ）变态反应。
A. Ⅰ型B. Ⅱ型C. Ⅲ型D. Ⅳ型三、多项选择题（每题至少有2个及以上答案，多选、少选均不得分。
实验六 新城疫实验室诊断
10
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11 12 稀释度 1∶2 1∶22 1∶23 1∶24 1∶25 1∶26 1∶27 1∶28 1∶29 1∶210 1∶211 1∶212 生理盐水
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25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 鸡胚液 25 25 25
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来说，出现临诊症状的鸡所占的比例及发病鸡的严峻程度可能有很大差异。 后继续卵乳化 24/ml，开始照蛋每日两次，连续 5 日，弃去 24h 内死胚，
典型 ND 的特征性病变是全身呈出血性败血改变：腺胃乳头出血或溃疡； 收集 24~ 120h 死胚和剩余活胚置 4℃保持，鸡胚液〔尿素液和羊水〕 置
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实验六 新城疫实验室诊断
的血液与 1／4 体积的抗凝剂混合，用 PH7.2、0.01mol／LPBS 液洗涤 3 次， 每次均以 3000rpm 离心 10min，洗涤后用 PBS 配成体积分数为 1％红细胞
试验六 新城疫的试验室诊断 〔一〕试验目的 1．把握鸡新城疫的临诊诊断要点。 2．把握鸡胚接种、病毒分别方法并用 H、HI 试验鉴定其病毒 〔二〕试验原理 有些病毒，如禽流感病毒、新城疫病毒、Eds76 等，能凝集某种动物 的红血球，故可以来推想材料中有无该病毒的存在。如有能凝集血球的病 毒，其凝集性可为相应的抗体所抑制，这种抑制还有特异性，故病毒的血 球凝集抑制试验，可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体，也可用已 知血清来鉴定未知病毒。 〔三〕试验预备 抗凝剂的制备：5%枸椽酸钠+0.9%生理盐水，分装、纱布扎口、灭菌 消毒 15 磅/20min。 1％红细胞悬液制备：采集无禽流感和新城疫等抗体的健康成年公鸡
职业院校技能大赛“鸡新城疫抗体水平测定”赛项规程
职业院校技能大赛“鸡新城疫抗体水平测定”赛项规程一、赛项名称赛项编号：GZ-108赛项名称：鸡新城疫HI抗体水平测定。
英语翻译：Detection of the antibody titer against the Newcastle disease virus赛项组别：高职组赛项归属产业：农林牧渔大类二、竞赛目的本赛项考核的核心技能是鸡的采血方法、1%鸡红细胞悬液配制、红血球凝集（hemagglutination，HA）试验操作与结果判定、四个血凝单位（HAU）病毒溶液配制、红血球凝集抑制（hemagglutination inhibiion，HI）试验操作与结果判定、HI抗体滴度报告撰写等技能。
本赛项考核的核心知识是《动物微生物学》、《兽医免疫学》、《兽医临床诊疗技术》、《动物传染病学》等专业课程理论知识。
本赛项由学校、行业、企业共设，是高职畜牧兽医专业的核心技能，通过技能竞赛有效促进学校建设并完善实验、实训平台，加强核心技能的训练，提升高职畜牧兽医专业的人才培养质量。
同时，通过竞赛方式也有效促进学校与企业之间的合作交流，推动高职畜牧兽医等专业教学改革和校企合作，共同培养畜牧兽医行业一线技能型人才。
三、竞赛内容该项目由两人配合完成，按照操作规程进行试验器材的准备，并进行标识，合理摆放；之后进行采血、离心、洗涤，配制1%鸡红细胞悬液；用微量移液器在96孔V形微量反应板上进行红血球凝集试验，测定新城疫标准抗原的血凝价；根据血凝试验测定的新城疫标准抗原的血凝效价，配制4个血凝单位病毒溶液；进行被检血清的血凝抑制试验操作，并设新城疫标准阳性血清对照、阴性血清对照；正确读取HI抗体滴度结果，并完成试验相关记录和测定结果报告。
四、竞赛方式本赛项为团体赛。
每组参赛学生2名，比赛由2名学生配合完成，参赛选手均为高职院校在籍学生。
每组选手限2名指导教师，指导教师须为本校专兼职教师。
五、竞赛流程本项目竞赛日程与流程安排见表1。
赛鸽新城疫抗体检测
２ ． １ 血 凝 及 结 果
１ ％鸡 血 球 的 制 备 ：５ ｍ ｌ 注 射 器 先
吸取 ２ ｍ ｌ 抗 凝 剂 ，然 后 采 集 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 血 ．
王蕾 赵 强 一 迪 成 德 信鸽 用 品 一 北 京， 一有 限菌 公Ｐ 司 １ ０ ０ ０ 一 离心 用灭 Ｂ Ｓ洗 ４遍 ， 前 ｉ 遍
１ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ， 离 心 ５ ｍｉ ｎ ， 最 后ｘ ｌ Ｐ Ｂ Ｓ液 于
各 孔 中 。 用 微 量 移 液 器 吸 取 待 检 血 清 ２ ５ Ｍ 置 于第 １ １ 孔 中 ，然 后 倍 比稀 释 至
１ ５ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ ，离心 １ ０ ｍｉ ｎ 。按 照体 积 比加
疫 一 次 新 城 疫 疫 苗 ， 免 疫 一 次 新 城 疫
集 的血 清最 大稀 释度 为该 血 清 的 Ｈ Ｉ 滴
度 ， 以 ２的 指 数 表 示 。 经 过 检 测 本 公 司 鸽 舍 免 疫 半 年 的 鸽 子 新 城 疫 抗 体 效
价为２ 。 ３ 分 析
抗原 效价 为 １ ：２ ５ ６ ．抗 原 做 ２ ５ ６ ／ ４ ＝ ６ ４倍 稀 释 。 即 取 ０ ． １ ｍ ｌ 抗 原 加 人
孑 Ｌ 至 第 ５孔 加 Ｐ Ｂ Ｓ ２ ５ １ ｘ １ ．微 量 移 液 器 吸 取 ４单 位 抗 原 ２ ５ １ ｘ １ 分 别 加 入第 １孔 中 ，从 第 １ 孔 开 始挤 压 ６ ～ ７次 混 合 ． 后 吸出 ２ ５ １ Ｍ 至第 ２孑 Ｌ ，依 次 倍 比稀 释
到 第 ５孔 ，弃 去 ２ ５ １ Ｍ。 用 微 最 移 液 器
察 结 果 。结 果 可 见 第 ８个 孔 全 部 凝 集 ． 而 第 ８个 孔 没 有 完 全 凝 集 。 这 样 判 断 随 着 近 年 赛 鸽 比赛 的 发 展 ，越 来
2022年鸡新城疫抗体水平测定赛项理论竞赛试卷6
全国职业院校技能大赛鸡新城疫抗体水平测定赛项理论竞赛试卷（六）工位号：考试时长：120分钟一、填空题（每空0.5分，共10分）1. 病毒衣壳的主要成分为。
2. 中枢免疫器官又称初级免疫器官，包括骨髓、法氏囊和。
3. 哺乳动物再次免疫应答后血清中含量最高的免疫球蛋白成分是。
4. 细菌在生长繁殖过程中产生和释放的具有损害机体组织、器官并引起生理功能紊乱的毒性成分是。
5. 当两种病毒感染同一细胞时，可发生一种病毒抑制另一种病毒复制的现象，称为病毒的现象。
6. 疫苗用量超过了一定限度后，免疫效果不但不增加，还可能导致免疫受到抑制，称为。
7. 侵入动物机体的病毒不能杀死宿主细胞，二者形成共生平衡，使动物长期处于感染状态，并且经常或不定期地排出病毒，但常无症状，称为感染。
8. 口蹄疫病以口腔粘膜、蹄部、乳房发生和糜烂为特征。
9. 蓝舌病的传播媒介是。
10. 常用于分离鸡新城疫病毒所用鸡胚日龄是。
11. 传染性法氏囊发病2~3天，病毒含量最高的器官是。
12. 绦虫虫体可分头节、体节和。
13. 猪囊尾蚴寄生于猪的，其成虫寄生于人的小肠。
14. 某1000只肉鸡群，4周内发病500只，死亡300只，该病的病死率是 %。
15. 动物出现某病特有症状的感染称为感染。
16. 急性猪瘟的典型淋巴结病理变化是。
17. 容易形成长久疫源地并难以根除的疫病是。
18. 病毒的增殖方式是。
19. 病毒是自然界中最小的微生物，测量单位为。
20. 吸虫幼虫的发育一般包括毛蚴-包蚴- -尾蚴-囊蚴五个时期。
二、单项选择题（每小题1分，共10分）1. 基因组有8个节段的病毒是（）。
A.马立克氏病病毒B.禽流感病毒C.新城疫病毒D.禽传染性支气管炎病毒2. 引起母猪繁殖障碍的疱疹病毒是（）。
A.猪传染性胃肠炎病毒B.猪细小病毒C.猪圆环病毒I型D.伪狂犬病病毒3.鸡群暴发传染性法氏囊病时，控制该病最好紧急注射（）。
A.疫苗B.中药制剂C.抗生素D.高免卵黄抗体4.动物传染病的预防措施中，属于预防接种的措施是（）。
新城疫抗体水平检测
新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开 一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。
2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。
二、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体三、实验原理1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。
2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。
抗体病毒颗粒红细胞四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。
1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。
（二）10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。
2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。
3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、2-6摄氏度储存，备用。
（三）血凝试验（HA)1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul生理盐水2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。
3.每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul4.轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟5.结果判定血凝效价测定结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。
新城疫HI抗体监测
（2）HA方法与步骤(μL)
孔号 1 2 3 ……. 10 11 对照
病毒稀释倍数
21
22
25 25 25 25
23
25 25 25 25
……. 210
…….. 25 …….. 25 …….. 25 …….. 25
211
25 25 25 25 25 弃去25 25 25
生理盐水或PBS 25
25 病毒（已知） 生理盐水或PBS 25 1%红细胞悬液 25
D.
3、病毒的红细胞凝集试验（HA）
（1）凝集价的测定
（2）HA方法与步骤 （3）判定结果
（1）凝集价的测定
将已知病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA 试验，出现血凝现象的各稀释孔中，能使红细胞完全 凝集的病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价。又称为 该病毒的血凝滴度。 4单位病毒 即将一个血凝单位的稀释度增加4倍浓度， 例如一个血凝单位为 1:64 ， 4 个血凝单位则为 64/4=16 倍稀释。
新城疫HI抗体监测
王晓泉 刘慧谋
新城疫（newcastle disease,ND）是由新城疫 病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度 接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神 经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的 发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传 染病。 病鸡是本病的主要传染源，鸡感染后临床症状 出现前24小时，其口、鼻分泌物和粪便就有病 毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体 液、分泌物和排泄物中。
96孔V型微量反应板、微量振荡器、 病毒材料、红细胞悬液、生理盐水或 PBS、微量移液器、注射器、抗凝剂、 离心机、恒温箱等。
四、实验步骤和方法
1. 血清样品的采集、运送和保存 2. 制备鸡红细胞悬液 3. 病毒的红细胞凝集试验（HA） 4. 病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）
1-鸡新城疫抗体水平测定
附件1：高职农林牧渔专业类鸡新城疫抗体水平测定赛项技能竞赛规程、评分标准及选手须知一、竞赛内容本项目为鸡新城疫抗体水平测定（微量法），测定方法按《新城疫抗体诊断技术》（GB/T16550-2008）标准进行。
本赛项不设理论考试，只对技能操作进行综合考核，技能竞赛题为公开试题，见本赛项规程的主要技术规程及要求。
二、竞赛方式本赛项为2人小组赛，以院校为单位组队参赛，不得跨校组队。
三、竞赛时量比赛时间为3小时。
比赛时由参赛队自行确定分工完成相关竞赛内容。
四、名次确定办法本赛项满分100分，采用分项计分法。
按总分由高到低排序，总分相同按完成时间先后排序，用时少者列前；若二项均相同，则按抗体滴度报告、西凝试验得分高低依次排序。
五、评分标准与评分细则1．评分标准及分值项目技能竞赛评分标准及分值见表1。
表1 项目技能竞赛评分标准及分值2．评分细则项目技能竞赛评分细则见表2。
表2 项目技能竞赛评分细则六、赛点提供的设施设备仪器清单仪器设备按《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2008）标准要求配制，且均为常用仪器、设备与材料。
本赛项所用的仪器、设备与材料见表3。
七、选手须知（一）主要技术规程及要求鸡新城疫抗体水平测定（微量法）按《新城疫抗体诊断技术》（GB/T16550-2008）标准进行,具体步骤及其分值如下：（一）试验器材准备（占总成绩的8%）按照操作规程进行器材准备，要求器材摆放有序，物品标识合理，桌面整洁等。
（二）配制1%鸡红细胞悬液（占总成绩的18%）按照操作规程进行采血、离心、洗涤、配制1%鸡红细胞悬液，要求采血规范、熟练、采血量适量、离心机使用规范、洗涤次数及洗涤时间适宜等。
（三）血凝试验（占总成绩的20%）按照操作规程，用微量移液器在96孔V型血凝反应板滴加稀释液、新城疫标准抗原，充分混匀，倍比稀释后，添加1%鸡红细胞悬液，充分振荡混匀，正确判定抗原的血凝效价。
要求微量移液器使用规范、倍比稀释操作规范、结果正确等。
新城疫抗体水平测定方法
新城疫抗体水平测定方法一、背景介绍新冠病毒疫情爆发以来，全球范围内都在积极抗击疫情。
其中一个重要的指标就是人体对新冠病毒的抗体水平。
因此，开发一种准确、快速、可靠的新城疫抗体水平测定方法对于控制疫情和保障公共卫生至关重要。
二、实验材料1.血清样本：采集患者或者健康人群的血清样本。
2.ELISA试剂盒：包括酶标板、酶标板封闭剂、酶标板洗涤缓冲液、检测抗体试剂和检测抗体阳性对照品等。
3.洗板机：用于洗涤酶标板。
4.微孔吸光度计：用于读取吸光值。
三、实验步骤1.准备工作（1）将试剂盒从-20℃低温保存室中取出并放置于室温下30分钟左右恢复至常温。
（2）将样本放置于室温下30分钟左右恢复至常温。
（3）将洗板机预热至37℃。
2.制备样本（1）将血清样本离心10分钟，取上清液，用PBS稀释至1：100。
（2）将酶标板取出，每孔加入100μL封闭剂，室温下放置30分钟。
（3）倒掉封闭剂，每孔加入100μL稀释后的血清样本或阳性对照品，室温下放置60分钟。
（4）倒掉样本或阳性对照品，每孔加入300μL洗涤缓冲液，在洗板机中洗涤5次。
3.检测抗体（1）倒掉洗涤缓冲液，每孔加入100μL检测抗体试剂，室温下放置30分钟。
（2）倒掉检测抗体试剂，每孔加入300μL洗涤缓冲液，在洗板机中洗涤5次。
4.结果分析（1）将每个酶标板孔内的吸光值读取并记录下来。
（2）计算阳性对照品的平均吸光值，并根据试剂盒说明书计算出检测样本中新城疫抗体的相对水平。
四、实验注意事项1.严格按照试剂盒说明书操作，避免操作失误。
2.样本处理过程中要注意消毒和无菌操作。
3.酶标板和试剂应当在规定温度下保存，并在使用前充分恢复至常温。
4.洗板机的使用要按照说明书进行，避免出现故障。
五、实验结果解读根据试剂盒说明书，可以将检测样本的抗体水平分为阴性、弱阳性、阳性和高阳性四个级别。
其中，阴性表示检测样本中没有新城疫抗体；弱阳性表示检测样本中的新城疫抗体水平较低；阳性表示检测样本中的新城疫抗体水平明显升高；高阳性表示检测样本中的新城疫抗体水平非常高。
鸡新城疫的免疫检测程序
教学实习内容一．鸡新城疫的免疫检测目的：系统掌握鸡新城疫的抗体检测技术。
实验材料：新城疫疫苗、待测鸡蛋、生理盐水、5%柠檬酸钠、1%鸡红细胞悬液、胶头滴管、注射器、锥形瓶、15ml离心管、试管、96孔V型板、离心机等1.1%鸡红细胞悬液的制备（1）每组采取3ml左右健康鸡静脉血，迅速注入装有约0.3-0.4ml抗凝剂的离心管内，轻轻颠倒混匀；（2）加入适量生理盐水，混匀，3000rpm*10min，吸弃上清液和红细胞沉淀上层的白细胞层（3）加入适量生理盐水，重悬红细胞，3000rpm*10min，吸弃上清液。
如此，重复3次。
（4）量取红细胞沉淀的体积，用生理盐水配成1%的红细胞悬液，待用。
2.HA试验1%红细胞根据所用NDV液的凝集价，配制4单位病毒液。
3.HI试验（1）待测卵黄样品的制备：用镊子敲破鸡蛋小头，将蛋清倒去，留蛋黄在蛋壳内；吸取0.5ml 生理盐水，放入小试管内；去掉部分蛋壳，用1ml注射器（不带针头）吸取蛋黄0.5ml，加到有生理盐水的试管内，混匀（避免其很多泡）待检。
（2）按照检测血清抗体的方法检测卵黄中的抗体。
被检鸡蛋卵黄1%红细胞（3）判定和记录所检测鸡蛋的卵黄抗体效价。
结果与分析对所测得的结果进行分析，确定该鸡群目前的免疫状态，并对生产提出合理建议或给出科学指导。
分析并指出影响本实验结果的主要因素。
二．传染病的分子生物学检测——PCR检测（以PCV2为例）1.DNA提取：将猪肝脏称重后，按照1:3（W:V）的比例加入PBS，用组织研磨器研磨成组织悬液，反复冻融3次后8000 rpm离心5 min，取上清300 μL提取DNA。
取冻融、离心后的组织悬液/血清300μL，加入300 μL细胞裂解缓冲液和5 μL的蛋白酶K(20 mg/mL)，混匀，置50 ℃消化2 h，每隔30 min，剧烈震荡一次；加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混匀后，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；用酚：氯仿：异戊醇（25:24: l）重复抽提一次；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，加入2倍体积冰预冷的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L醋酸钠（pH 5.2），室温放置30 min 以沉淀基因组DNA；4 ℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清；用75%乙醇1 mL 洗涤沉淀，4 ℃ 12 000 rpm 离心10 min后，弃去上清，自然晾干。
鸡新城疫抗体水平测定技能大赛竞赛规程
附件-12019年河北省高等职业院校鸡新城疫抗体水平测定技能大赛竞赛规程一、比赛的职业、标准、形式和内容（一）职业：动物疫病防治员。
（二）标准：（三）比赛形式1.本赛项内容由理论测试与技能测试两部分组成，其中理论知识占总分30%，技能操作占总分70%。
2. 实际操作比赛要求在规定时间内进行操作，到达预订比赛结束时间，停止一切操作，所占比重为总成绩的70%；3. 参赛代表队由6名选手组成，每个代表队设领队1人，指导教师1人，不得超出。
（四）比赛内容本竞赛重点考查参赛选手鸡新城疫抗体水平测定的实践操作能力，具体包括：1. 配制1%鸡红细胞悬液采血方法规范、熟练、抗凝剂量使用合理；天平使用、离心机使用、灭菌生理盐水洗涤红细胞操作规范、熟练；正确配制1%鸡红细胞悬液。
2. 血凝试验移液器加样规范；倍比稀释时混匀充分，试剂不滴加到孔外,吸头更换操作规范；1%红细胞悬液加之前应充分混匀，边滴加边震荡混匀。
准确判定完全凝集的病毒的最高稀释倍数作为1个血凝单位。
3.准确计算并配制4个血凝单位病毒溶液10-20ml, 微量移液器吸取和打出液体操作规范。
4.血凝抑制试验移液器加样规范；倍比稀释时混匀充分，试剂不滴加到孔外，吸头更换操作规范；1%红细胞悬液加之前应充分混匀，边滴加边震荡混匀。
感作时间适宜，结果无跳孔现象，判读结果准确。
二、竞赛用仪器、设备与材料仪器设备按《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2008）标准要求配制。
本赛项三、参考资料四、评分规定理论测试：理论测试时间为60分钟，满分100分，主要测试动物疫病防治员岗位相关理论知识。
占总评成绩30%。
技能测试：鸡新城疫抗体水平测定技能比赛时间为180分钟，评分为六个部分：试验器材准备、配制1%鸡红细胞悬液、血凝试验、配制4个血凝单位病毒溶液、血凝抑制试验、抗体滴度报告,共计总分为100分，占总评成绩70%。
（一）评分标准（二）个人成绩的计算取参赛选手理论考试成绩乘以0.3，再加上其实际操作成绩乘以0.7，二者之和即为参赛选手的总成绩。
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2013年龙岩市第二届中等职业院校教师教学技能大赛农林牧技术“新城疫抗体测定”比赛规程
一、比赛项目
比赛设二个项目：1.片段教学（含板书） 2.专业技能
二、参赛对象、资格审查及组队方式
⒈参赛对象：龙岩市中等职业学校农林牧技术类在职在岗教师。
⒉资格审查：各校做好本校参赛教师的资格审查工作。
比赛时参赛选手须带身份证和抽签号。
资格审查时应主动提供给评委和工作人员检查。
证明材料不一致或不符合要求的提请组委会决定是否取消参赛资格。
⒊组队方式：各中职学校每校选拔1-3人参加。
三、比赛地点与时间安排
1．比赛地点：龙岩市农业学校
2．比赛时间：2013年11月23日
四、比赛内容
总分（共计）200分，片段教学（100分）、专业技能（100分）
（一）片段教学比赛（评分标准见附件）
1.教材范围：中国农业出版社中等职业教育课程《动物微生物与检验》）
2.比赛内容：每位参赛教师按照抽签顺序号进入备课室，根据现场抽选课题进行备课（时间为50分钟），备课结束后按抽签顺序号进行片段教学，由评委现场评分。
3.比赛要求：比赛时间15分钟（不少于10分钟且不超过15分钟）。
片段教学应能体现课程新理念，重点突出，贴近专业，能积极引导学生互动，并有
效开展对学生的评价；板书按照片段教学内容要求自行设计，应当文字清晰、设计得当、布局合理、体现学科特点。
备课的课题教材（复印件）、备课纸均由大赛组委会提供，比赛现场选手不得携带与比赛相关的资料。
片段教学时选手只能携带备课教材复印件、备课稿进入片段教学考室。
（二）新城疫抗体测定项目（评分标准见附件）
在规定90分钟内，参赛教师完成新城疫抗体测定项目（微量法）。
（1）试验器材准备按照操作规程进行试验器材的准备，并进行标识，合理摆放
（2）血凝试验按照操作规程使用微量移液器在96孔V型血凝反应板滴加稀释液、新城疫标准抗原并充分混匀和递倍稀释，添加1%鸡红细胞悬液，充分振荡和感作，正确判定出1个血凝单位。
（3）配制四单位病毒根据HA试验测定的新城疫标准抗原的血凝效价，按照操作规程配制四单位病毒。
（4）血凝抑制试验按照操作规程进行被检血清的血凝抑制试验操作，并设新城疫标准阳性血清对照。
（5）抗体滴度报告按照操作规程正确读数，并完成报告单填写。
五、比赛场地与设施
七、参赛选手须知见附件
八、奖项设置
按照龙岩市教育局市人力资源和社会保障局市总工会《关于举办龙岩市第二届中等职业院校教师教学技能大赛的通知》（岩教综〔2013〕203号）文件奖项设置要求执行。
片段教学评分标准及分值。