高效液相色谱-荧光检测法同时测定人体尿液中的多种蝶呤类化合物

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时稀释至所需要的浓度。 1.3样品前处理 取晨尿1.O mL置于5 mL塑料离心管中,加6.O mol/L盐酸1~2滴,O.05 mol/L碘一碘化钾氧化液
1.O mL,于暗处放置30
min,滴加0.05 mol/L抗坏血酸还原液1.O mL,摇匀,加水至5.0 mL,经O.45“m
的微孔滤膜过滤后,进行色谱分析。
表5健康人尿样加标回收(n=5)
TabIe 5 Recovery of the urine sample
弘g/mL和0.15弘g/mL。加标平均回收率在84.8%~120.o%之间。用该方法测定了 健康人、普通病人和癌症病人尿样中的蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤,发现癌症病人 尿样中的新蝶呤水平与健康人和普通病人相比有所升高,生物蝶呤水平有所降低。该 方法准确,可行,适用于临床上尿样中蝶吟类化合物的检测。 关键词:蝶呤类化合物;人体尿液;高效液相色谱;荧光检测
实验部分
1.1仪器与试剂 Agilentlloo高效液相色谱仪(美国,Agilent公司),配荧光检测器,Agilent液相色谱工作站;KQ- 50DB数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司);TDL一5一A型低速台式离心机(上海安亭科学仪 器厂);MS2型迷你振荡器(广州仪科实验室技术有限公司);Millipore_Q Gradient超纯水装置(美国,Mi卜
所降低。
表l健康人尿样的分析结果(疗=6)
Table 1 The anaIyticaI I‘esuIts of urine sampIes
fr咖healthy people(n==6)
9 10 11 12 13 14
O.428±O.023 2.559士O.072 2.050±O.057 2.570士O.014 O.399士O.050 3.49l士O.016
中,加6.o mol/I。的盐酸1~2滴,加o.05 mol/L碘一碘化钾氧化液1.o mL,于暗处放置30 min,滴加o.05
mol/L抗坏血酸还原液1.o mL,摇匀,加水至5 mI。,经O.45弘m的微孔滤膜过滤得进样液。(3)取晨尿
1.o
mI。置于5 mL塑料离心管中,加入O.1 mL
min,12 000
O.018±O.010 1.519±O.026 1.656 2.375±O.021 O.114±O.005 1.059士O.027
O.261±O.006 O.679土O.059 ND ND O.082 O.614±O.008
ND ND ND ND ND ND
表3癌症病人尿样的分析结果(捍=6)
TabJe 3 1'he anaIytical r鹤ults of urjne
mL、O.002 pg/mL、O.001弘g/mL和O.15 pg/mL。
2.3样品前处理方法的选择
人体尿液成分复杂,为保证分析结果的准确性,考察了以下三种样品前处理方法:(1)取晨尿1.o
mL,
经0.45肛m的微孔滤膜过滤,定容至5 mL容量瓶中,待测。(2)取晨尿1.o mL置于5 mI。塑料离心管
s棚pl器from啪cer
patients(一=6)
Sample
Neopterin
Biopterin
Pterin
Sepiapterin
(弘g/mL)
3 O1 5

(“g/mL)
3 447 O 24 1

(“g/mL)
O 472 O 43

oo
(pg/mL)
ND ND ND ND ND ND

万方数据
lipore公司)。
收稿日期:2010一06一08 修回日期:2010—09一02
基金项目:国家自然科学基金(No.20765002);江西省自然科学基金(No.0620049)
。通讯作者:万益群,男,教授,博士研究生导师,研究方向:生命化学及色谱分析.
21
万方数据
第1期
崔盼盼等:高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的多种蝶呤类化合物
的色谱条件进行分析,单个水平重复实验3次。结果表明:三种方法的平均回收率在80.2%~120.o%之 间,均能满足实际样品分析要求。但方法2、3与方法1相比,蝶呤、新蝶呤和生物蝶呤的荧光响应强度明 显增高。方法3与方法2相比,尿样色谱图中新蝶呤附近的杂质峰较多,干扰其测定,所以本实验采用方 法2对尿液进行前处理。
O.05~2.0肛g/mL、o.01~1.o pg/mL和O.3~10.o pg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,其 线性回归方程分别是:y一217.5lz一1.127(r=0.9990);y一313.43z+12.622(r—o.9982);v一517.61z
+2.2659(r—o.9995);y一5.1618z—o.1447(,.=o.9998);以三倍信噪比计算,检出限依次是:o.003“g/
速为1.O mL/min时,新蝶呤、蝶呤、生物蝶呤和墨
三.
‘晶 £
旦 .兰
。 岳 o





O 5 lO



15
20
25
30
Time/min
图l
Fig.1
四种蝶呤类化合物的色谱分离图
Chromatogram of four pteridin器 pg/mL);2.Biopterin(O.1肛g/mL);3.Pterin
第27卷第1期
V01.27 No.1
分析科学学报
JOURNAI。()F ANAI。YTI(、AI,S(、IENCE
2011年2月
Feb. 201 1
文章编号:1006—6144(2011)ol—002l—05
高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的
多种蝶呤类化合物
崔盼盼,万益群。
(南昌大学分析测试中心,江西南昌330047) 摘要:建立了高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的蝶呤、新蝶呤、生物蝶 呤和墨蝶呤。尿液在酸性条件下经碘一碘化钾溶液氧化30 min,滴加抗坏血酸还原液 后,可进行液相色谱分析。色谱柱为Diamonsil C18柱,用体积比9:10的水一甲醇为流动
5 6 7
OO6
O O 11

O O7 1 O O 15 O OO5 O O2 8
3 29 O O 3 87 3 571 3

O 43 6

OO9
O 16
2 6O
O O 56
O O
O5
O●
l8 l9 20 a:j±s;b:not detected.
O O3 9
O 927 O 6 5 4 +一士±土士
O5

O 343
86 土士±士± O O 2 6
025
O 6 O 1 ±士士±士 O O 5 2 O.110
3.297土O.036
O.323
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第1期
崔盼盼等:高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的多种蝶呤类化合物
表4普通病人及癌症病人信息
’rable 4 Sample 9 10 11 12 13 14 Status fracture fracture fracture common cold
2.4尿样分析
取健康人、普通病人和癌症病人的晨尿,按选定的样品前处理方法及色谱条件进行分析,每个尿样平 行测定6次,尿样分析结果见表1~3,各癌症病人及普通病人信息见表4(1~8号健康人尿样由南昌大学 志愿者提供;9~14号普通病人尿样由江西省中医院提供;15~20号癌症病人尿样由南昌大学一附院提 供)。实验结果表明,癌症病人尿样中的新蝶呤水平与健康人和普通病人相比有所升高,生物蝶呤水平有
第27卷
蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤标准品均购自于美国Sigma公司;甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂均
为分析纯;水为超纯水。 1.2标准溶液的配制
准确称取适量的蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤的标准品分别置于4个25 mI。的棕色容量瓶中,加 数滴1.O mol/L Na()H溶液溶解,用超纯水稀释至刻度,摇匀,配成浓度分别是:蝶呤84.8"g/mI。、新蝶 呤90.O pg/mI。、生物蝶呤80.O pg/mL和墨蝶呤74.O pg/mL的标准储备液,置于冰箱内4℃保存,使用
Status colon gastric skin
cancer
female male male male female female
cancer
cancer
gastric cell lung
cancer
con吼on
cold
cancer
common cold
cancer
2.5
回收率与精密度试验
Байду номын сангаас
取8号健康人及18号癌症病人尿样进行加标回收实验,分别添加三个不同水平的蝶呤、新蝶呤、生物 蝶呤和墨蝶呤的标准溶液,每个水平均测定5次,结果见表5和表6。四种蝶呤类化合物的平均回收率在 84.8%~120.o%之间,相对标准偏差(RSD)小于7.34%。表明本法测定结果准确可靠。
中图分类号:0657.7+2 文献标识码:A
蝶呤类化合物(Pteridines)在生物体代谢过程中起重要的辅助作用,可作为体内“淋巴细胞一巨噬细胞 轴”所介导的细胞免疫防御系统激活程度的标志物,体液中其水平的高低反映了体内细胞免疫状态,已用 于多种疾病的监测Ⅲ。主要的几种蝶呤类化合物包括蝶呤(Pterin)、新蝶呤(Neopterin)、黄蝶呤(Xan— thopterin)、异黄蝶呤(Isoxanthopterin)、蝶呤一6一羧酸(Pterin一6一carboxylic acid)、生物蝶呤(Biopterin)和墨 蝶呤(Sepiapterin)等。其中,以新蝶呤的研究最为广泛,已应用于临床上多种类型疾病的诊疗∞4],其它蝶 呤类化合物相对研究较少¨柚]。墨蝶呤是蝶呤类化合物的一种,目前主要研究对象为动物细胞及人体脑 脊液,对人体尿液中墨蝶呤含量检测的研究鲜有报道。 本文系统探讨了人体尿液中蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤的色谱分离条件,同时考察了尿液的前 处理方法,在此基础上,建立了四种蝶呤类化合物同时分析的新方法,并应用于健康人、普通病人和癌症病 人尿样检测,取得了较好的效果。 1
1.O
mol/L的盐酸和5mg二氧化锰,摇匀,于暗处放置30
min,取上清液振荡10 瓶中,待测。
r/min下离心10 min,经o.45肛m的微孑L滤膜过滤,定容至5 mL容量
将上述三种方法处理得到的空白尿样及添加蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤标准溶液的尿样按选定
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万方数据
第1期
分析科学学报
第27巷
第27卷
InfOmati伽0f
Sex
Ordinary patien协and SampIe 15 16 17 18 19 20
cancer
patients Sex male male male male male female Age 48 65 76 53 63 59
Age 79 69 8 24 34 22
相,流速为1.O mL/min,荧光检测波长为.:I。。一360 nm,A。=445 nm。新蝶呤、生物蝶
呤、蝶呤和墨蝶呤的线性范围分另q是O.005~1.5弘g/mL、0.05~2.0肛g/mL、O.01~
1.O pg/mL和0.3~10.0
pg/mL,检出限依次为0.003 pg/mL、O.002肛g/mL、O.001
1.Neopterin(O.1 (O.1
pg/mI,);4.Sepiapterin(1.5 pg/mI。).
蝶呤的色谱分离效果较好,荧光响应强度较高,分析 时间较短,尿液中共存物质对其测定无影响且系统压力不高。四种蝶呤类化合物的色谱图见图1。
2.2标准曲线与检出限
取适量的标准储备液,分别配制一系列不同浓度的标准工作液,按选定的色谱分离条件进行分析,并 以峰面积对浓度作图。结果表明:新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和墨蝶呤的含量分别在O.005~1.5肛g/mL、
1.4色谱条件
Diamonsil
C,。色谱柱(250×4.6 mm,5弘m);柱温为室温;流动相:水一甲醇一90:10(V/V);流速为1.o
nm,A。=445 nm。
mL/min;进样量为10“L;荧光检测波长为A。。=360
2结果与讨论
2.1流动相的组成及流速的选择
分别采用甲醇一水、乙腈一水、甲醇一磷酸盐缓冲溶 液(pH=6.56,7.0,7.43)作流动相,考察了不同流 动相配比及流速对四种蝶呤类化合物色谱分离行为 的影响。结果表明:乙腈一水体系作流动相时,墨蝶 呤的荧光响应强度不高,且四种蝶呤类化合物的保 留时间过小,尿液中的共存物质对其检测干扰较大; 甲醇一磷酸盐缓冲溶液(pH=6.56,7.O,7.43)作流 动相时,生物蝶呤和蝶呤的分离效果不够理想;甲 醇一水体系作流动相且当甲醇:水一lO:90(V/V),流
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