离心技术和细胞器分离
06实验六--细胞器的分离与观察nj
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部, 迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织 倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀 浆完毕,移入1.5ml离心管中。
(3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和 生化方法进行形态和功能鉴定。
Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）
细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性 的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲 基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两 类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA 被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分 布显示出来。
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。
六、实验报告
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进 行？
2. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离 和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实 际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶 液哪一种在下层? 有什么作用?
实验六细胞器的分离与观察一细胞核的分离与观察二线粒体的分离与观察一实验目的了解细胞器的分离原理掌握差速离心和密度梯度离心技术二实验原理细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官为了研究各种细胞器的功能首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来
超现代实验技术：离心技术---精品管理资料
超速离心技术超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术.离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。
离心技术可分为制备型和分析型两类。
在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质，如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等.也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。
处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。
离心技术的范围相当广泛。
目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸。
因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。
自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机（45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间，离心机的发展是非常迅速的。
特别是在50年代以后发展的更快，例如,美国贝克曼(Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE）,日本的日立（HITACHI)公司以及德国的海吕斯（Heraeus）公司，都生产出各种离心机产品，如普通离心机、高速离心机和超速离心机。
从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。
美国贝克（Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制，分离—检测，全部实现自动化;最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。
此外,离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。
虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。
在实际工作中用的最多的还是制备型离心。
本课程主要介绍制备型分离技术。
细胞组分的分级分离
离心机机型 低速离心机 高速离心机 超速离心机
转速 8 000转/分 8 000~25 000转/分 25 000 ~ 80 000转/分
分离方法
❖ 差速离心分离法：利用不同离心速度产生的不同离 心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。
❖ 密度梯度离心分离法：将要分离的细胞组分铺放在密 度逐渐增加的介质表面，在超速离心力的作用下， 不同的组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的 沉降带。
线粒体含量较多；长度适合观察，约5μm；肝脏较软，易 于破碎，并且适于快速提取，因而利于保持线粒体活性。
细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其 他微体、核糖体和大分子。
詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线 粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持 氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹 纳斯绿B被还原成无色的化合物。
一半肝组织，0.25M蔗糖洗3次，加3ml 0.25M蔗糖，剪碎
匀浆（5-8次），6层纱布过滤至10ml离心管 取出1ml至dorf管（A），3000rpm，10min
沉淀加入1ml 1M蔗糖，悬
上清入dorf管(B)
涂片1 涂片2
3800rpm,10min
12000rpm,20min
弃上清，沉淀加少量 0.25M蔗糖，悬
❖ 离心技术：
1. 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基 本手段。
2. 转速为10-25kr/min的离心机称为高速离心机。
3. 转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。
4. 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。
颗粒直径 103nm 102~104nm 102nm
离心技术与细胞器分离
溶酶体：细胞内消化和降解的主要场所负责 分解和消化细胞内的物质。
06
细胞壁：植物细胞特有的结构负责维持细胞 的形状和保护细胞。
细胞核：储存遗传信息控 制细胞活动
线粒体：能量转化提供细 胞活动所需的能量
内质网：蛋白质合成、加 工和运输
高尔基体：蛋白质的修饰、 包装和运输
溶酶体：分解和消化细胞 内的物质
技术挑战：离心法分离细胞器在提高分离效率、降低成本等方面仍面临 挑战
发展趋势：未来离心法分离细胞器将朝着智能化、自动化、高效化方向 发展
展望：离心法分离细胞器将在生物医学、生物技术等领域发挥越来越重 要的作用为人类健康和社会发展做出更大贡献。
汇报人：
在离心力作用下分离
应用：在细胞生物学、生物 化学、医学等领域广泛应用
生物医学领域：细胞、病毒、蛋白质等生物样品的分离和纯化 化学领域：有机化合物、无机化合物等化学样品的分离和纯化 环境科学领域：土壤、水、大气等环境样品的分离和纯化 食品科学领域：食品成分、添加剂等食品样品的分离和纯化 工业领域：金属、非金属等工业样品的分离和纯化 科研领域：各种样品的分离和纯化用于科学研究和开发
细胞膜：保护细胞控制物 质进出细胞
细胞核： 控制细胞 生长、分 裂和遗传 信息的传 递
线粒体： 提供能量 参与细胞 呼吸
内质网： 参与蛋白 质合成、 脂质合成 和运输
高尔基体： 参与蛋白 质的加工、 分类和运 输
溶酶体： 分解衰老、 损伤的细 胞器或细 胞
细胞膜： 控制物质 进出细胞 参与细胞 信号传递
优点：操作简单分离效果好速度快可重复性好 缺点：对细胞有一定的损伤可能会影响细胞活性和功能 优点：可以分离出多种细胞器包括线粒体、内质网、高尔基体等 缺点：需要一定的设备如离心机成本较高
差速离心在细胞生物学领域的基本应用
差速离心在细胞生物学领域的基本应用差速离心（Differential Centrifugation）是一种基础的分离技术，常用于细胞生物学领域。
它通过使用离心力，将混合物中组分按照密度或大小分离出来，从而可以获得纯净的细胞组分，进而进行研究和分析。
差速离心的基本原理是利用不同组分在离心过程中受到离心力的不同作用，使其在离心管中的位置发生变化。
该技术可以根据离心产生的离心力大小和离心时间来控制不同组分的分离效果。
差速离心在细胞生物学领域的基本应用主要有以下几个方面：1.分离细胞器和亚细胞组分：差速离心可以将细胞分离成细胞器和亚细胞组分。
通过逐级离心，可以获得比较纯净的线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器，进一步研究它们的结构和功能。
2.分离细胞核：差速离心能够利用细胞核较高的密度，将细胞核与细胞质分离。
通过离心操作，可以将细胞核纯化出来，用于DNA和RNA的提取、核蛋白的分离和研究细胞核的功能。
3.分离膜蛋白：膜蛋白是细胞中重要的功能分子，涉及许多生命活动，如信号转导、物质转运等。
差速离心可以分离细胞膜并提取膜蛋白，通过进一步的研究，可以了解膜蛋白的结构特征和功能机制。
4.分离细胞核糖体：细胞核糖体是合成蛋白质的重要细胞器，其大小和密度都与其功能相关。
差速离心可以通过离心力的调节，将细胞核糖体分离并获得不同大小的亚型，用于研究蛋白质合成的机制和调节。
5.分离细胞外泡：细胞外泡是细胞外释放的一种细胞间通讯方式，含有多种生物分子，如miRNA、mRNA、蛋白质等。
差速离心可以将细胞外泡纯化出来，并进行分析，探究其在细胞间通讯和疾病发生发展中的作用。
总的来说，差速离心是细胞生物学中常用的一种分离技术，可以根据细胞组分的不同密度和大小，将它们分离出来并纯化，为进一步研究细胞的结构、功能和相互作用提供基础。
该技术在细胞生物学、分子生物学和生物医学研究中具有重要的应用价值，为我们深入了解生命的本质和探索疾病的发生机制提供了有力的工具。
《生命科学导论》重要知识点汇总六
《生命科学导论》重要知识点汇总六151.离心分离技术离心分离技术主要用于分离细胞器、生物大分子及其复合物。
分为差速离心和等密度离心两种,其中差速离心主要用于分离沉降系数不同的细胞组分,而等密度离心则用于分离沉降系数相似但密度不同的细胞组分。
差速离心是指低速与高速离心交替进行的离心方法,利用不同的离心速度所产生的不同离心力,使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来。
沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒,可以用此法分离。
差速离心是分离较大细胞器(如细胞核、线粒体)及各种大分子颗粒的基本手段。
等密度离心主要用于分离沉降系数差别不大，而密度相差较大的组分。
利用离心介质在离心管内形成一连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部。
离心一段时间后,不同密度的颗粒沉降到与其密度相同的位置停止沉降,聚集成区带,从而达到彼此分离的目的。
152.细胞化学技术1.细胞化学染色法为了显示蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，常利用显色剂与所检测物质的某个特殊基团特异性结合,通过颜色来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。
2.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术是对细胞内特异性蛋白质进行定位与定性的最有效的方法。
随着20 世纪70年代单克隆抗体技术的出现，免疫学技术取得了突飞猛进的发展,为细胞生物学的研究提供了强有力的手段。
常见的细胞内蛋白质分子定位技术有免疫荧光技术.免疫电镜技术。
3)原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法称为原位杂交(hybridization in situ)。
153.定量细胞化学技术定量细胞化学技术是一种对细胞或组织中蛋白质或核酸等化学成分进行定量分析的技术,分为细胞显微分光光度技术和流式细胞仪技术。
细胞显微分光光度技术是利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞内的含量,包括用紫外光显微分光光度计测定和用可见光显微分光光度计测定。
动植物细胞器离心法分离课件
平衡离心法
通过控制离心力的大小， 使物质达到平衡状态，从 而实现分离。
02
动植物细胞器的介绍
动植物细胞器的定义
定义
细胞器是细胞内具有一定形态和功能 的结构，它们是细胞的基本组成部分 ，包括线粒体、叶绿体、内质网、高 尔基体等。
结构
功能
细胞器在细胞的生命活动中起着至关 重要的作用，它们参与了细胞的代谢 、能量转换、物质运输等多种功能。
验结果。
在实验结束后应及时记录实验 数据和结果，并进行总结和分
析。
实验结果误差分析
在分析实验结果时应排除可能的误差 因素，如试剂污染、仪器故障等。
在分析实验结果时应结合相关理论知 识，对实验结果进行深入分析和解释 。
应通过重复实验或增加样本量等方式 ，提高实验结果的稳定性和可靠性。
在撰写实验报告时应按照规范要求， 准确描述实验过程、结果和结论，为 后续研究和应用提供可靠的依据。
动植物细胞器的分类
按形态分类
可分为球形、扁平形、管 状等不同形态的细胞器。
按功能分类
可分为能量转换器、合成 与分解器、信号转导器等 不同功能的细胞器。
按膜结构分类
可分为单层膜、双层膜、 无膜等不同膜结构的细胞 器。
03
离心法在动植物细胞器 分离中的应用
离心法在动物细胞器分离中的应用
动物细胞器的分离
离心
将酶解后的样品放入 离心管中，用离心机 进行高速离心。
分离
根据不同细胞器的密 度和大小，使用不同 的介质进行分离。
纯化
通过多次离心和漂洗 ，将细胞器从其他杂 质中分离出来。
实验结果分析
通过显微镜观察分离 后的细胞器形态和结 构，判断分离效果。
对分离的细胞器进行 定量和定性分析，比 较不同样品之间的差 异。
差速离心法分离细胞器
差速离心法分离细胞器
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速
度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高
的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
物体围绕中心轴旋转时会受到离心力f的作用。
当物体的质量为 m、体积为v、密度
为d、旋转半径为r、角速度为（弧度数/秒）时，可得：f=mω2r 或者f=v.d.ω2r （1）上述表明：被离心物质所受到的离心力与该物质的质量、体积、密度、离心角速度以及旋
转半径呈正比关系。
离心力越大，被离心物质沉降得越快。
在离心过程中，被离心物质
还要克服浮力和摩擦力的阻碍作用。
浮力f}和摩擦力f}}分别由下式表示：
f’=v.d’.ω2r （2）f’’=f dr/dt （3）其中d}为溶液密度，f为摩擦系数，dr/dt
为沉降速度（单位时间内旋转半径的改变）。
在一定条件下，可有：f=f’+f’’ v.d. ω2r =v.d’ω2r + f. dr/dt dr/dt =vω2r (d-d’)/f (4) 式(4)表明，沉降速度与被
离心物质的体积、密度差呈正比，与f成反比。
若以s表示单位力场（ω2r=1）下的沉降
速度，则 s=v (d-d’)/f s即为沉降系数。
沉降系数对于生物大分子来说，多数在
(1~)×10-13秒之间。
为应用方便起见，人们规定1×10-13秒为一个单位（或称1s）。
一般单纯的蛋白质在1~20s之间，较大核酸分子在4~s之间，更大的亚细胞结构在30～s 之间。
细胞和细胞器及间质的分离
第三章细胞和细胞器及间质的分离细胞内各种结构的比重、大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，所以常用不同介质、不同转速、不同时间，通过分级离心，将细胞内各种结构组分（细胞核、核仁、线立体、高尔基复合体、溶酶体、染色体等）分离出来。
主要方法是：组织匀浆的制备、离心分级分离各组分、分析鉴定三个步骤。
一、细胞的分离根据细胞的大小、密度常可分离不同具有不同生物学特征的各种细胞亚群。
其原理是处于悬液中的细胞沉降率与细胞的直径成比例，也与细胞密度和分离介质密度之间差异成比例，假设细胞为球形，则其在溶液中在引力场内的沉降速度以下列公式表示V= 2g(ρc–ρs)r²9η遵循Stokes定律，其中：ρc和ρs分别是细胞和溶液的密度，η为溶液粘度，r为细胞半径，g为重力加速度。
根据细胞直径（大小）的分离方法：主要是速度下降。
细胞在单位引力下，通过低密度介质，或在低离心力作用下，通过密度梯度沉降。
由于细胞大小不同，沉降速度不同，细胞越大沉降越快。
根据细胞密度分离是等密度分离，就是细胞在连续密度梯度分离介质中，在强离心作用下，细胞最后到达与其自身密度相同的分离介质层面，并能保持平衡，在非连续密度梯度中，分离的细胞主要集中于介乎其自身密度两种密度介质的交界面上，从而达到分离。
操作方法：（一）单位重力沉降法：分离介质主要是牛血清白蛋白，其分离的细胞活性高、费用也昂贵。
现已用蔗糖替代，仍能取得较好的分离效果。
1．在固定沉降池上方加入30ml PBS/BSA，含有细胞1×108于池底。
2．从池周边加入50ml PBS覆盖于样品上，不要使整个界面破坏。
3．下口接1％蔗糖梯度液，稍松下口，缓慢放入50ml 1%蔗糖梯度液，约10ml/min。
4．接通梯度混合仪，从下口加入1200ml 1~2%蔗糖梯度液，速度为50ml/min。
5．最后加入500ml 2.5%蔗糖梯度液。
6．整个沉降系统，于4℃，静置4h，这时细胞按大小先后沉降，未成熟的红细胞在先，成熟的网织红细胞在最后。
实验六细胞器的分离与观察
0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、
甲基绿
Байду номын сангаас
-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离
（1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹 部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组 织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。 匀浆完毕,移入1.5ml离心管中。
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的 蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相， 在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能， 保持酶的活性，避免细胞器的聚集。
沉淀
转速x时间
A 150g x 20min
B 1000g x 20min
C 3000g x 6min
D 10000g x20min
E 105000g x120min
（2）离心：低温离心机中进行。 每次离心前 一定要在天平（托盘天平）上将两离心管配平。 第一次以600g离心10min。将其上清夜移入 Eppendorf管中，盖好盖子置于冰浴中，留待 后面使用(分离线粒体)。沉淀使用1ml预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次，每次 1000g离心10min。
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速
（r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。
离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离 心
动植物细胞器离心法分离
2．差速离心： 将0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入离
心管，然后沿管壁小心地参加4.5mL鼠肝 匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离 心按以下图顺序进行差速离心。
第十一页，共二十六页。
别离细胞核：
鼠肝匀浆700×g离心10 min
沉淀(细胞核及质膜碎片)
上清液(1)
洗涤(0.25 mol／L预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次，每 次1000×g离心15 min。
第二十页，共二十六页。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收 光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短 的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)， 这种光就称为荧光。假设停止供能荧光现象立即停止。 有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧 光(称为自发荧光)，如叶绿素的火红色荧光。有的生 物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能 发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可 发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶 绿体进行观察。
沉淀。
5．将上清液在3000 r／min下离心5 min．弃去上清液， 沉淀即为叶绿体(混有局部细胞核)。
第二十三页，共二十六页。
6．沉淀用0.35 mol／L氯化钠溶液悬浮。 7．取叶绿体悬液l滴置于载玻片上，加盖玻片后用普
通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将 叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加l滴 0.01％吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即 可观察。 8．观察叶绿体的形态结构、测量5~10个叶绿体的长
将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用 差速离心法可以别离细胞线粒体。在一定的离心 场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速 度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在 一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的 各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停 留在上下不同的位置。依次增加离心力和离心时 间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后 顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核 糖体和大分子。
细胞膜和细胞器的分离提纯方法（附图）
细胞膜和细胞器的分离提纯方法细胞中的膜结构是整个细胞及多种细胞器的界膜，对于保持细胞和细胞器的独立性是必不可少的，同时很多重要的功能是在膜结构上完成的。
为了研究细胞膜和细胞器的结构与功能，首先要分离出形态与结构完整的、具有生物活性的、纯度高的样品。
在研究工作中，分离细胞膜和细胞器可以用以下方法。
首先是制备一定量的细胞，细胞的来源可以是培养细胞，也可以是某种组织。
培养细胞的收集相对简单一些，直接用胰酶将细胞从培养瓶上消化下来，制成细胞悬浮液。
比较易碎的组织细胞的收集如肝、脾等，可采用匀浆的方法，稍加研磨就可制成细胞悬液。
有些结缔组织，直接研磨不易分离出细胞，可先用适量的胶原酶处理。
细胞制备出来后，进行匀浆处理。
匀浆的方法有多种，如用高速打碎机破碎，低渗，玻璃珠与细胞共振荡，冻融法，超声波打碎等。
可根据实验需要和实验室条件来选择。
无论选择哪种方法，都要尽可能保持膜的完整性。
整个操作过程要避免过于激烈，pH、离子强度和渗透压等条件要适中，一般常用中性和等渗溶液。
匀浆产生的细胞裂解物，可通过一系列差速离心再加上一个梯度离心来分离细胞膜与细胞器，梯度是根据细胞器的大小、密度和沉降特性来设计的。
匀浆分步分离的第一步是差速离心，在一系列的离心过程中离心力逐渐加大，并且将细胞器加入到具有密度梯度的介质中离心，常用的分离介质有蔗糖、甘油、葡聚糖等。
由于每种细胞器的大小和沉降特性不同，因此可被分离出来。
如果只是分离细胞中的某种细胞器，可直接根据那种细胞器所对应的相对离心力，在细胞匀浆后进行离心分离。
哺乳动物红细胞的结构比较简单，其细胞膜可用低渗离心的方法分离出来。
如果是独特的细胞膜，可根据表面电荷的密度采用电泳的方法分离，也可根据大小采用凝胶过滤的方法分离。
（摘自人教版生物1分子与细胞必修教师教学用书，图引自《基础生命科学》高等教育出版社）。
高速离心技术在生物学上应用
高速离心技术在生物学上应用高速离心技术在生物学上的应用一、引言高速离心技术是利用高速旋转的离心力场，使物质在离心管中沉降或分离的一种实验技术。
由于其具有高效、快速、简便等优点，高速离心技术在生物学领域得到了广泛的应用。
本文将从样品制备、分离纯化、分析检测等方面阐述高速离心技术在生物学上的应用。
二、样品制备在生物学实验中，样品制备是至关重要的一步。
高速离心技术可用于从复杂的生物样品中提取所需的组分，如细胞、细胞器、蛋白质、核酸等。
例如，在细胞生物学研究中，常用高速离心技术分离不同类型的细胞，如红细胞、白细胞和血小板。
此外，高速离心技术还可用于制备细胞膜、细胞核、线粒体等细胞器，以及分离和纯化蛋白质、核酸等生物大分子。
三、分离纯化高速离心技术在分离纯化方面也具有广泛的应用。
通过调整离心速度和时间，可以实现不同大小、密度和形状的分子的分离。
例如，在蛋白质研究中，常用高速离心技术分离和纯化蛋白质，包括粗分蛋白质、去除杂质蛋白质、分离不同分子量的蛋白质等。
此外，高速离心技术还可用于分离和纯化核酸、多糖等生物大分子，以及从生物样品中提取和纯化特定的生物活性物质。
四、分析检测高速离心技术还可用于生物样品的分析检测。
例如，在临床医学中，常用高速离心技术检测血常规指标，如红细胞计数、白细胞计数和血小板计数等。
此外，高速离心技术还可用于检测生物样品中的特定成分，如蛋白质浓度、核酸浓度等。
同时，结合其他实验技术，如电泳、色谱等，可以实现对生物样品中复杂成分的分析和鉴定。
五、结论高速离心技术作为一种重要的实验手段，在生物学领域得到了广泛的应用。
它不仅可用于样品制备、分离纯化和分析检测等方面，还可与其他实验技术相结合，实现对生物样品中复杂成分的分析和鉴定。
随着科学技术的不断发展，高速离心技术在生物学领域的应用将越来越广泛。
未来，随着新型离心机的研制和实验技术的改进，高速离心技术将在生物学研究中发挥更加重要的作用。
同时，随着生物学研究的不断深入和发展，对高速离心技术的要求也将越来越高。
差速离心分离细胞器顺序
差速离心分离细胞器顺序
在生命科学研究中，差速离心分离细胞器是一种非常重要的技术，通过使用离心分离力，可以在细胞饱和中良好地分离不同细胞器。
首先，在差速离心分离细胞器的过程中，细胞被放入特定的离心管里，被沿着离心管的两端分别施加不同的速度或加速度，从而形成一个从内向外的梯度，结果会形成一个分离的梯度，各种细胞器的分离梯度不同，很多基因表达分析都要借助于此。
其次，为了达到最佳的差速离心分离细胞器效果，往往需要采用复杂的参数，比如每种细胞器所携带的分子量，分离梯度的斜率，离心分离设备的转速，离心管的体积等等。
这些参数都是非常重要的，对最终离心分离结果影响至关重要。
综上所述，差速离心分离细胞器是一种重要的细胞分离技术，既可以应用在基因表达分析中，也可以应用在分析细胞器的组成成份和功能上，但需要专业的研究人员根据具体情况，仔细调整好各项参数，以达到最佳的分离效果。
cscl密度梯度离心法原理
cscl密度梯度离心法原理
CSCL密度梯度离心法是一种常用的生物分离技术，主要用于分离细胞、细胞器和蛋白质等生物大分子。
其原理是根据样品在不同密度梯度中的浮力差异来实现分离。
在实验中，样品被置于密度梯度管中，然后放入离心机中进行离心。
经过离心后，样品中的不同分子或细胞组分会分布到不同密度梯度上，并形成一些密度梯度层。
通过收集这些密度梯度层，就可以分离出不同分子或细胞组分，从而达到分离和纯化的目的。
该技术具有操作简单、分离效果好、纯度高等优点，广泛应用于生物学和医学领域。
- 1 -。
离心技术与细胞器分离
• 8. 再把3ml 60%percoll CSK buffer 轻轻的平铺于7的溶液上 方, 用移液枪加时一定要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一 溶液之上. 这时应该能观察到溶液明显的分层现象.
• 9. 然后把6中过滤溶液轻轻的平铺于8的溶液上方。观察分 层现象。
• RCF= (mω2r )/(mg)=1.119×10-5 n2r
式中r为离心转子的半径距离，指离心管的 重心至转轴中心间的距离，以cm为单位；g 为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转 子每分钟的转数（rpm）。
离心力的转换列线图
离心机的基本分类
离心机
概述
制备性 普通离心机 冰冻离心机
CSK buffer: 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose. 60%percoll CSK buffer ： 60%percoll, 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose.
• 离心力（centrifugal force，Fc） • 相对离心力（relative centrifugal force，
RCF）
离心力（centrifugal force，Fc）
• 离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运 动时受到的一个向外的力。
• 离心力（Fc）的大小取决于角速度与旋转 uffer，先向研钵中倒入5ml后开 始研磨。
• 3．四层纱布过滤，收集过滤液到10ml离心管中， 再将剩下的5ml匀浆buffer 冲洗研钵后也过滤到管 中，5000rpm离心5分钟, 去上清。
分离各种细胞器的方法
分离各种细胞器的方法
1. 离心离心法：利用离心力将细胞器分离，可以分离出线粒体、核鞘体、线粒体鞘体、线粒体膜、细胞质和细胞核等细胞器。
2. 浊度分离法：利用细胞器的不同浊度，将细胞器从浊液中分离出来。
3. 离子交换法：利用细胞器对离子的吸附性，从而将细胞器从溶液中分离出来。
4. 膜分离法：利用细胞器膜的通透性，将细胞器从溶液中分离出来。
5. 免疫分离法：利用抗体来分离某一类细胞器，抗体可以结合特定的细胞器，从而将其从混合溶液中分离出来。
差速离心法分离细胞器的原理
差速离心法分离细胞器的原理
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
差速离心原理：差速离心法最普通的离心法，即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。
此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较 大时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
Density gradient centrifugation
Density gradient centrifugation
实验步骤
• 1．将材料用蒸馏水洗净。用滤纸吸干水后,去叶脉, 称取2克叶片,用剪刀剪碎后放入研钵。
差速离心法 （differential velocity centrifugation）
密度梯度离心
• 原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力 场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或 向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相 等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长 时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。 从而使不同浮力密度的物质得到分离。
•
Fc= mω2r
• 其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；r 是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位； m是质量，以g为单位。
相对离心力（relative centrifugal force，RCF）
• 又称相对离心加速度，是指离心力相当于 重力加速度的倍数。在文献中常用“相对 离心力”或“数字×g”表示。
• 10. 3200g离心32分钟，溶液梯度层重新分布。
• 11.分别吸取一些各层的溶液进行改良品红苯酚染色、镜检 。观不同大小不同密度的细胞器的分布情况以及他们的 形态特征。
试剂
K．匀H浆2PbOuf4f,e0r.：3M5m山M梨M醇E,S0,.36.M8m甘M露C醇aC, 0l2.,41％1mPVMP-30
CSK buffer: 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose. 60%percoll CSK buffer ： 60%percoll, 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose.
• 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替 进行离心，使沉降系数不同的颗粒在不同 的分离速度及不同的离心时间下分批分离 的方法，称为差速离心法。
• 常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。
The preparative ultracentrifuge
Figure 8-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
离心技术与细胞器的分离
一 实验目的
1、以分离叶绿体、细胞核为例,掌握离心机的操作 技术及两种不同的离心方法：差速离心法、密度梯 度离心法;
2、光镜鉴定各种细胞器的提取情况及了解叶绿体、 细胞核的形态。
二 实验原理
• 离心技术（centrifugal technique）是根据 颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向 外的力这一原理而发展起来的一种分离技 术。
• 7. 把含有2.3M蔗糖的CSK buffer 3ml加至于离心管底部.
• 8. 再把3ml 60%percoll CSK buffer 轻轻的平铺于7的溶液上 方, 用移液枪加时一定要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一 溶液之上. 这时应该能观察到溶液明显的分层现象.
• 9. 然后把6中过滤溶液轻轻的平铺于8的溶液上方。观察分 层现象。
• RCF= (mω2r )/(mg)=1.119×10-5 n2r
式中r为离心转子的半径距离，指离心管的 重心至转轴中心间的距离，以cm为单位；g 为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转 子每分钟的转数（rpm）。
离心力的转换列线图
离心机的基本分类
离心机
概述
制备性 普通离心机 冰冻离心机
• 2．量取10ml 匀浆buffer，先向研钵中倒入5ml后开 始研磨。
• 3．四层纱布过滤，收集过滤液到10ml离心管中， 再将剩下的5ml匀浆buffer 冲洗研钵后也过滤到管 中，5000rpm离心5分钟, 去上清。
• 4．加入 0.5% TritonX-100 2.5ml, 混匀，振荡后静 置3分钟. 5000rpm离心5分钟，去上清。
• 离心力（centrifugal force，Fc） • 相对离心力（relative centrifugal force，
RCF）
离心力（centrifugal force，Fc）
• 离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运 动时受到的一个向外的力。
• 离心力（Fc）的大小取决于角速度与旋转 半径，即：
分析性 分析性超速离心机
台式（或地 面式）普通 离心机
台式高、超 速离心机 0.6-10万转/ 分以上
大容量冰 冻离心机
小于0.6万 转/分
高速冰冻 离心机
0.6-2.5万
超速冰冻 离心机
2.5-8万或 更高
离心机的结构
• 离心机的主要部件为转头、主轴、电动机 和传动装置、制动器、外壳和机座。
• 离心机的转头主要有：角度转头（angle-headed rotors）、甩平式水平转头（swing-out rotors）/ 吊桶式转头（swinging bucket rotors）
水平转头
角度转头
离心技术类型
• 常用离心技术一般包括： • 差速离心法（differential velocity
centrifugation） • 密度梯度离心法(density gradient
centrifugation)。
差速离心法 （differential velocity centrifugation）
• 5．加入1ml CSK buffer 振荡混匀,可以用枪头轻轻 吹打沉淀使其溶解.
• 6．滤膜过滤（300目）, 去掉未裂解的原生质体及裂解的细 胞膜内溶物等大块杂质，收集过滤液。
以上步骤所提到的细胞核不纯,其中混杂有原生质体、线粒 体、叶绿体, 下面采用蔗糖密度梯度离心分离细胞核和叶绿 体。
2.3M sucroseCSK buffer: 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 2.3M sucrose.