放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法

2）曲线的高度取决于[RT]。在曲线起始段，曲线上升的 曲线的高度取决于[RT]。在曲线起始段， [RT] 快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以， 快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，KD 亲和力越大) 饱和曲线上升越快，KD越大 越小 (亲和力越大)，饱和曲线上升越快，KD越大 (亲和 力越小) 饱和曲线上升越慢。 力越小)，饱和曲线上升越慢。 （即：亲和力越大，受体 与配件结合速度越快，时间越短）
根据质量作用定律： v1 = k1 [R] [L] ；v2 = k2 [RL] 当反应达到平衡后， v1 = v2 , 即: k1 [R][L] = k2 [RL] ,则 平衡解离常数（KD）的数学表达式为： KD＝K2/ K1=[R][L]/[RL] （2）
Scatchard作图 作图
设[LT]为配体的初始浓度，[RT]为受体的初始浓度（即受体总量），则有： [L] = [LT] – [RL] [R] = [RT] – [RL] 由式（ ）整理可得： 由式（2）整理可得 KD ＝ [RT-RL][L] [RL] 将上式整理可得： 将上式整理可得 [RL] = [RT] － 1_ × [RL] [L] KD KD
2、制备膜受体
大鼠断头取脑 分离出目标组织 加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次， 每次20分钟 弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低 温高超离心机 试剂： 试剂：超纯水
饱和曲线
固定的受体数量， 固定的受体数量，固定数量的非标和不同 浓度体积的放射性配体
饱和曲线(saturation curve) 饱和曲线
1）饱和曲线 ）
受体数量一定，当配体（ 受体数量一定，当配体（一般是不同浓度体积的放射 性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时， 性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成 的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限， 的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反 因此[RL]（受体配体复合物）的增加不是直线上升， 应，因此 （受体配体复合物）的增加不是直线上升， 而是一条上升先快后慢的曲线， 而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体 结合时，[RL]的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经 结合时， 的增加就非常缓慢，渐趋水平， 的增加就非常缓慢 饱和了， 饱和了，此即饱和曲线 。 #饱和曲线的作用？Scatchard作图，求得 与Bmax 饱和曲线的作用？ 作图， 饱和曲线的作用 作图 求得KD与
化合物每次实验做两复管，进行两次单独 实验。
8、各种指标
IC50：半数抑制浓度 KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为 受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。 Bmax：受体最大结合容量（fmol /mg蛋白 质） nH：Hill系数
Scatchard方程与作图 （饱和实验）
Scatchard方程与作图
枪头
200ul
1ml
10ul
Tris
PPO与POPOP
过滤装置
砂芯过滤装置（抽滤 瓶） 1000ml
Whatman GF/C玻璃 微纤维滤纸 40mm
放射性化合物
放射性配体 低温保存
实验方法流程
实验方法流程
制备受体样品； 1、制备受体样品； 加样、温育进行结合反应； 2、加样、温育进行结合反应； 终止反应， Байду номын сангаас、终止反应，分离结合物与游离物 测定结合物的放射性； 4、测定结合物的放射性； 数据处理。 5、数据处理。
漩涡混合器 WH-2
低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机 GELIN 型号IMS-50 automatic ice flakes
电热恒温水温箱
循环水式多用真空泵
液闪测定计数仪 HIDEX， 425-034型
实验材料
2ml离心管
6ml一次性软试管
RBA的分类 RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基， RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 用放射性核素来标记配基 进行特异性结合反应， 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 和定量的分析。 定性RBA RBA： 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式， 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 定量RBA RBA： 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应， 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数 受体数及结合的 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
实验具体操作（D1、D2、5-HT）
1、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 配制各种非标记配体溶液 配制各种受试药物溶液 注意：该项操作所需试剂或仪器 注意 该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、 试管、EP管等 试剂： 试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降 宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、 DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、 Butaclamol及5HT 等
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析 （radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。
图2 [RT]对饱和曲线影响 对饱和曲线影响
数学表达
law)： 质量作用定律 (Mass action law)： 受体和配基的结合反应服从可逆反应的质 量作用定律，可用下式表示: 量作用定律，可用下式表示: k1, v1 [R]+[L] －－－－ [RL] k2, v2
（ 1）
上式中，[R]和 为游离受体和游离配基的浓度，[RL]为复合物 上式中，[R]和[L] 为游离受体和游离配基的浓度，[RL]为复合物 浓度，v1和v2为结合速率和解离速率 k1和k2为结合速率常数 为结合速率和解离速率， 浓度，v1和v2为结合速率和解离速率，k1和k2为结合速率常数 (association rate constant) 和解离速率常数 (dissociation rate constant)。 constant)。
3、加样 加样
取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定 浓度的膜受体溶液。 取放射性配体母液， 取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
5 、分离游离及结合的放射性配体
上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装 置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲 洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随 后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁 液，浸泡过夜。 注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器： 抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液 闪杯 试剂： 试剂： 甲苯、PPO 、POPOP
注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等 试剂： 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液 放射性配体母液
4、 受体配体结合反应 、
以上各管在加完放射性配体后，立即放入 37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后 把各管放入冰中终止反应。 注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂： 试剂：无
6、 测定结合型放射配体每分钟放射计数 、
采用放射性计数仪，测定各测试管中结合 型放射配体每分钟放射计数 注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器： 液闪仪 试剂： 试剂： 无
7、数据处理
按以下公式计算各化合物对同位素配基结 合的抑制率百分率：
抑制率(I %)=（总结合管cpm—化合物cpm）/ （总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%
简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜率为 -（1/KD）， 作图为一条直线， 简单单位点系统 作图为一条直线 （ ）， 横轴截距为[RT]，纵轴截距为 横轴截距为 ，纵轴截距为[RT]/ KD（见图 ）。 （见图3）。
简单单位点系统RBA的Scatchard作图 图3 简单单位点系统 的 作图 由此求得KD与Bmax
实验材料与仪器
实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高 速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）