放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法

注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等 试剂： 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液 放射性配体母液
4、 受体配体结合反应 、
以上各管在加完放射性配体后，立即放入 37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后 把各管放入冰中终止反应。 注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂： 试剂：无
化合物每次实验做两复管，进行两次单独 实验。
8、各种指标
IC50：半数抑制浓度 KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为 受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。 Bmax：受体最大结合容量（fmol /mg蛋白 质） nH：Hill系数
Scatchard方程与作图 （饱和实验）
Scatchard方程与作图
图2 [RT]对饱和曲线影响 对饱和曲线影响
数学表达
law)： 质量作用定律 (Mass action law)： 受体和配基的结合反应服从可逆反应的质 量作用定律，可用下式表示: 量作用定律，可用下式表示: k1, v1 [R]+[L] －－－－ [RL] k2, v2
（ 1）
上式中，[R]和 为游离受体和游离配基的浓度，[RL]为复合物 上式中，[R]和[L] 为游离受体和游离配基的浓度，[RL]为复合物 浓度，v1和v2为结合速率和解离速率 k1和k2为结合速率常数 为结合速率和解离速率， 浓度，v1和v2为结合速率和解离速率，k1和k2为结合速率常数 (association rate constant) 和解离速率常数 (dissociation rate constant)。 constant)。
实验具体操作（D1、D2、5-HT）
1、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 配制各种非标记配体溶液 配制各种受试药物溶液 注意：该项操作所需试剂或仪器 注意 该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、 试管、EP管等 试剂： 试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降 宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、 DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、 Butaclamol及5HT 等
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析 （radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。
根据质量作用定律： v1 = k1 [R] [L] ；v2 = k2 [RL] 当反应达到平衡后， v1 = v2 , 即: k1 [R][L] = k2 [RL] ,则 平衡解离常数（KD）的数学表达式为： KD＝K2/ K1=[R][L]/[RL] （2）
Scatchard作图 作图
设[LT]为配体的初始浓度，[RT]为受体的初始浓度（即受体总量），则有： [L] = [LT] – [RL] [R] = [RT] – [RL] 由式（ ）整理可得： 由式（2）整理可得 KD ＝ [RT-RL][L] [RL] 将上式整理可得： 将上式整理可得 [RL] = [RT] － 1_ × [RL] [L] KD KD
漩涡混合器 WH-2
低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机 GELIN 型号IMS-50 automatic ice flakes
电热恒温水温箱
循环水式多用真空泵
液闪测定计数仪 HIDEX， 425-034型
实验材料
2ml离心管
6ml一次Baidu Nhomakorabea软试管
简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜率为 -（1/KD）， 作图为一条直线， 简单单位点系统 作图为一条直线 （ ）， 横轴截距为[RT]，纵轴截距为 横轴截距为 ，纵轴截距为[RT]/ KD（见图 ）。 （见图3）。
简单单位点系统RBA的Scatchard作图 图3 简单单位点系统 的 作图 由此求得KD与Bmax
简单单位点系统受体和配体结合反应（ 模型） 简单单位点系统受体和配体结合反应（Clark模型） 模型 条件： 条件： （1）配基与受体结合反应为可逆双分子反应； ）配基与受体结合反应为可逆双分子反应； （2）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不 ）所有受体都是等效和独立的， 同分子对配基的亲和力都相等， 同分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体 分子结合配基与否的影响； 分子结合配基与否的影响； （3）配体本身不代谢，也不与其它位置结合； ）配体本身不代谢，也不与其它位置结合； （4）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。 ）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。
6、 测定结合型放射配体每分钟放射计数 、
采用放射性计数仪，测定各测试管中结合 型放射配体每分钟放射计数 注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器： 液闪仪 试剂： 试剂： 无
7、数据处理
按以下公式计算各化合物对同位素配基结 合的抑制率百分率：
抑制率(I %)=（总结合管cpm—化合物cpm）/ （总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%
枪头
200ul
1ml
10ul
Tris
PPO与POPOP
过滤装置
砂芯过滤装置（抽滤 瓶） 1000ml
Whatman GF/C玻璃 微纤维滤纸 40mm
放射性化合物
放射性配体 低温保存
实验方法流程
实验方法流程
制备受体样品； 1、制备受体样品； 加样、温育进行结合反应； 2、加样、温育进行结合反应； 终止反应， 3、终止反应，分离结合物与游离物 测定结合物的放射性； 4、测定结合物的放射性； 数据处理。 5、数据处理。
Hill方程与作图
当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是 简单的双分子反应，而是 k1, v1 根据质量作用定律推导出Hill方程： Hill方程 [R]+n[L] －－－－ n[RL] ，根据质量作用定律推导出Hill方程： k2, v2
2、制备膜受体
大鼠断头取脑 分离出目标组织 加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次， 每次20分钟 弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低 温高超离心机 试剂： 试剂：超纯水
3、加样 加样
取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定 浓度的膜受体溶液。 取放射性配体母液， 取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
RBA的分类 RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基， RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 用放射性核素来标记配基 进行特异性结合反应， 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 和定量的分析。 定性RBA RBA： 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式， 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 定量RBA RBA： 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应， 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数 受体数及结合的 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
5 、分离游离及结合的放射性配体
上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装 置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲 洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随 后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁 液，浸泡过夜。 注意： 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 仪器： 抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液 闪杯 试剂： 试剂： 甲苯、PPO 、POPOP
2）曲线的高度取决于[RT]。在曲线起始段，曲线上升的 曲线的高度取决于[RT]。在曲线起始段， [RT] 快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以， 快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，KD 亲和力越大) 饱和曲线上升越快，KD越大 越小 (亲和力越大)，饱和曲线上升越快，KD越大 (亲和 力越小) 饱和曲线上升越慢。 力越小)，饱和曲线上升越慢。 （即：亲和力越大，受体 与配件结合速度越快，时间越短）
方程） （ Scatchard 方程）
变形：[RL]为受体与配基特异结合的量，换成[B]表示，[L]为自由配基的量，换成[F]表示， [RT]为受体总量，也即受体最大结合量，换成[Bmax]表示，则上式方程变为 B/F=Bmax/KD - B/KD 为受体总量，等于[R]和 之和， （ [RT] 为受体总量，等于 和[RL]之和，也是最大结合量 max） 之和 也是最大结合量B 以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值 为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐 以复合物浓度 为横坐标 为纵坐 标作图，即为Scatchard作图。 作图。 标作图，即为 作图
饱和曲线
固定的受体数量， 固定的受体数量，固定数量的非标和不同 浓度体积的放射性配体
饱和曲线(saturation curve) 饱和曲线
1）饱和曲线 ）
受体数量一定，当配体（ 受体数量一定，当配体（一般是不同浓度体积的放射 性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时， 性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成 的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限， 的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反 因此[RL]（受体配体复合物）的增加不是直线上升， 应，因此 （受体配体复合物）的增加不是直线上升， 而是一条上升先快后慢的曲线， 而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体 结合时，[RL]的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经 结合时， 的增加就非常缓慢，渐趋水平， 的增加就非常缓慢 饱和了， 饱和了，此即饱和曲线 。 #饱和曲线的作用？Scatchard作图，求得 与Bmax 饱和曲线的作用？ 作图， 饱和曲线的作用 作图 求得KD与
实验材料与仪器
实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高 速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
实验仪器
组织匀浆机 IKA，T10B S25
k1, v1 [R]+[L] －－－－ [RL] k2, v2
KD＝K2/ K1=[R][L]/[RL]
饱和曲线的形状和KD有关（如图1） 饱和曲线的形状和 有关（如图 ）。 有关
图1 KD对饱和曲线的影响 对饱和曲线的影响
饱和曲线曲线的高度取决于[RT]（如图2）。 （如图 ）。 饱和曲线曲线的高度取决于