3-翻译起始因子

分子机制研究套路（三）

翻译起始因子

课题：受体A蛋白与真核翻译起始因子B相互作用的分子机制及功能研究

1．概念介绍：

众所周知，蛋白质是具有内在结构并能够发挥众多功能的一类生物大分子。蛋白质通常由二十种氨基酸通过不同的搭配组成，每一个蛋白质都是由一条或多条氨基酸分子形成的肤链组成。而多肤链中的氨基酸是由其对应的信使RNA(messengerRNA,mRNA)分子中的核酸基序决定的。mRNA分子要将自身携带的信息转化为不同功能的蛋白质，就必须通过翻译过程。整个翻译过程分为三步：翻译起始，翻译延伸和翻译终止。每一步过程都需要有许多蛋白质的参与，其中翻译的起始是整个过程的开端，意义重大。

翻译起始过程可被分为三步：首先，40S小亚基与翻译起始因子结合，在翻译起始因子的帮助下与mRNA模板结合；然后，在翻译起始因子和GTP的帮助下，Met-tRNA进入小亚基，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对；最后，由tRNA，mRNA，翻译起始因子组成的小亚基复合物与大亚基结合，伴随着GTP的水解，并释放出翻译起始因子。

真核翻译起始因子(eukaryotic initiationfactor，eIF)，是指参与和帮助真核细胞翻译起始这一过程的蛋白质。与原核翻译起始因子只有三种(IF1、IF2、IF3)相比，真核翻译起始因子种类多且复杂。通过这些真核翻译起始因子之间以及不同的真核翻译起始因子与其它细胞器或大分子(核糖体，mRNA，起始tRNA)之间的相互作用，来完成真核生物的翻译起始。对于真核生物来说，其翻译起始过程更多的依赖于蛋白质与蛋白质以及蛋白质与RNA之间的相互作用。

除了参与真核翻译起始进程之外，大多数真核翻译起始因子还有其他一些功能。比如参与细胞生长和细胞周期的调控，与某些疾病的发生相关等。

2．示意图：

3．研究思路：

3.1受体A与翻译起始因子B的相互作用 (3)

3.1.1酵母双杂交证实受体A-ICD（intracellular domain）与翻译起始因子B相互作用 (3)

3.1.2GST pull -down验证受体A-ICD与翻译起始因子B的相互作用 (3)

一）GST-翻译起始因子B与HA-受体A-ICD 的相互作用 (3)

二）GST-受体A-ICD与Myc-翻译起始因子B的相互作用 (4)

3.1.3体外翻译系统证实受体A-ICD与翻译起始因子B在体外能直接相互作用 (4)

3.1.4免疫共沉淀(Co-IP)验证受体A-ICD与翻译起始因子B的相互作用 (5)

3.2受体A-ICD与翻译起始因子B相互作用的定位 (5)

3.2.1翻译起始因子B通过其N端与受体A-ICD相互作用 (5)

GST pull-down实验证实翻译起始因子B通过其N端与受体A-ICD相互作用： (5)

3.2.2受体A-ICD通过TK结构域与翻译起始因子B相互作用 (6)

GST pull-down实验证实受体A-ICD通过TK结构域与翻译起始因子B相互作用： (6)

3.3受体A-ICD与翻译起始因子B在细胞内的共定位 (7)

3.4全长受体A与翻译起始因子B的相互作用 (7)

3.4.1GST pull-down实验证实受体A与翻译起始因子B能在体外结合 (7)

3.4.2免疫共沉淀(Co-IP)验证受体A与翻译起始因子B的相互作用 (8)

3.5受体A对5’端具有发夹结构的pcDNA3.1(+)-SL-LUC质粒翻译的影响 (8)

3.5.1构建pcDNA3.1(+)-LUC载体 (8)

3.5.2受体A对5'端具有发夹结构的pcDNA3.1(+)-SL-LUC质粒翻译的影响 (8)

3.1受体A与翻译起始因子B的相互作用

3.1.1酵母双杂交证实受体A-ICD（i ntra c ellular d omain）与翻译起始因子B相互作用

受体A-ICD和翻译起始因子B蛋白的自激活检测：

将质粒pAS2-l-受体A-ICD与pACT2-翻译起始因子B分别转化酵母宿主菌Y190，涂布于SD/-Trp/-His+3-AT和SD/-Leu/-His+3-AT固体培养基上，7天后，未见有克隆生长。结果表明两种载体表达的融合蛋白都不能自主激活报告基因。

受体A-ICD与翻译起始因子B在酵母体系中相互作用的验证：

利用氯化裡转化方法，将PAS2-1-受体A-ICD与pACT2-翻译起始因子B两种载体同时转化酵母宿主菌Y190，涂布于SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)固体培养基上，7天后有阳性克隆出现，直径大于2 mm，呈白色，苗壮生长。转接到新鲜的SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25 mM)固体培养基上，生长3-4天后，检测β-半乳糖苷酶活性。结果表明共转PAS2-1-受体A-ICD 和pACT2-翻译起始因子B质粒的酵母菌株以及阳性对照菌株的检测结果为阳性(酵母裂解产物变蓝)，对照组结果均为阴性，表明在酵母体内受体A-ICD与翻译起始因子B能够相互作用。

3.1.2GST pull -down验证受体A-ICD与翻译起始因子B的相互作用

一）GST-翻译起始因子B与HA-受体A-ICD的相互作用

重组蛋白GST-翻译起始因子B在大肠杆菌中的诱导表达及纯化：

将重组质粒pGEX-6P-l-翻译起始因子B及空载体pGEX-6P-l各自转化菌株BL21，0.5 mmol/L 的IPTG诱导16 h后，超声破碎菌体，将诱导前和诱导后的蛋白样品以及经Glutathione Sepharose 4B介质纯化的蛋白样品经SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色，脱色。含有重组质粒pGEX-6P-l-翻译起始因子B的宿主菌经超声破碎的裂解液上清在＿kDa位置略上处出现诱导表达带，与预期分子量基本一致，并且经Glutathione Sepharose 4B介质纯化后，可得到