荧光定量PCR引物设计
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NCBI 设计引物网址：
Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
The end ! Thank you!
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
1. NCBI Primer blast
选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon
勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （当以基因组DNA为模板时）
Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast
勾选时表示要检测引 物的特异性
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
Novobio Proprietary & Confidential
若有已知引物，可填 入，以测试特异性 针对sybr qPCR：产物大小填 100 to 200（最大不超过300）
可用默认值（最佳Tm为60度，波动范围 57 to 63度，两条引物Tm差值小于3度）
Primer blast
引物是否需跨不同Exon
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
Primer blast – 结果
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 1 搜索引物保守序列（与转录组避开
Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
The end ! Thank you!
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
1. NCBI Primer blast
选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon
勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （当以基因组DNA为模板时）
Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast
勾选时表示要检测引 物的特异性
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
Novobio Proprietary & Confidential
若有已知引物，可填 入，以测试特异性 针对sybr qPCR：产物大小填 100 to 200（最大不超过300）
可用默认值（最佳Tm为60度，波动范围 57 to 63度，两条引物Tm差值小于3度）
Primer blast
引物是否需跨不同Exon
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
Primer blast – 结果
2 beacon Designer 设计qPCR引物
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