基因克隆、假病毒操作步骤
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。
2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。
3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。
质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。
4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。
内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。
5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。
这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。
6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。
转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。
7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。
8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。
9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。
10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。
需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
克隆基因的操作流程
克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。
2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。
这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。
3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。
载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。
在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。
这个过程被称为“重组”。
4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。
5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。
这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。
6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。
通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。
克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。
基因工程操作技术及原理之基因克隆
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
PCR技术克隆目的基因全过程
实验：目的基因克隆（PCR技术）【课前预习】PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。
【目的要求】1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法。
2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。
【基本原理】类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
【实验用品】1．材料：重组质粒DNA作为模板2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机3．试剂：①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％Triton X-100。
②MgCl2 ：25mmol/L。
③ 4 种dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。
④Taq DNA聚合酶5U/μl。
⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：【方法步骤】（一）PCR反应1. 依次混匀下列试剂35μl H2 O 5μl 10×PCR反应缓冲液4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4种dNTP 0.5μl 上游引物（引物１）0.5μl 下游引物（引物２）0.5μl 模板DNA(约1ng) 混匀后离心5秒。
基因克隆 操作步骤原理及注意事项
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
1.基因克隆的步骤
基因克隆的步骤一、RNA的提取1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min；2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干；3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作；4. 室温静止5-15 min。
对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。
小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min；（必需步骤）6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA完全存在水相中；7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机相（小心避免吸到中间层）。
往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min；8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。
再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）；9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。
[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数[DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）二、M-MLV RT反转录1. oligo dT 1 uL + dNTP（2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水= 12 uLHeat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice；2. 上述12 uL液体+ 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uLMix contents of the tube，incubate at 37℃for 2 min3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uLIncubate tube at 25℃for 10 min；Incubate 50 min at 37℃；70℃for 15 min。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
基因克隆基本实验方法
重组质粒的连接、转化及筛选第一节概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。
也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。
带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
基因克隆的步骤
基因克隆的步骤嘿，咱今儿就来讲讲基因克隆那些事儿哈！你知道吗，基因克隆就像是一场神奇的魔法之旅。
首先呢，咱得找到那个我们想要克隆的基因，这就好比是在茫茫人海中找到那个特别的人。
怎么找呢？这可得有点技术和耐心啦！科学家们会用各种巧妙的方法，就像侦探在寻找线索一样，去把那个关键的基因给揪出来。
找到了基因，接下来就得给它找个“家”啦。
这“家”就是载体，就像是给这个基因找了个舒适的小房子，让它能安稳地待着。
然后呢，把基因和载体连接起来，让它们紧紧地结合在一起，就像好朋友手牵手一样。
再之后，就是把这个带着基因的载体送进细胞里啦。
这可不是随便找个细胞就行的哦，得找个合适的，就好像给这个基因找个最合适的“幼儿园”。
细胞就会把这个基因当成自己的一部分，开始按照基因的指令工作啦。
你想想，这多神奇啊！就这么一步步地，一个新的基因就被克隆出来啦。
这就好像我们自己动手搭积木，一块一块地搭起来，最后就变成了一个漂亮的城堡。
那为什么要做基因克隆呢？这用处可大了去啦！可以用来研究疾病的发生机制呀，说不定就能找到治疗那些疑难杂症的方法呢。
还可以用来生产药物，让那些救命的药变得更容易得到。
这就像给我们的健康上了一道保险一样，多让人安心啊！基因克隆可不是一件简单的事儿哦，得有专业的知识和技术，还得有耐心和细心。
就像厨师做菜一样，每一步都要恰到好处，不然味道可就不对啦。
所以说啊，基因克隆真的是一门高深又有趣的学问。
它让我们对生命的奥秘有了更深入的了解，也为我们的生活带来了很多的可能。
你说，这是不是很神奇呢？咱可不能小看了这基因克隆的步骤，每一步都有着它的重要意义呢！。
基因克隆详细步骤说明书
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。
42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿(三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨 (tryptone) 10g酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。
3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。
[实验步骤]1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。
3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。
在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。
注意：1mL的取液器设定在500mL。
基因克隆实验流程
基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。
一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
基因克隆的技术路线
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免疫法筛选
• 外源基因在细胞内表达出的蛋白质，可 与特异性的抗体结合。
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利用抗体筛选
原理 落 方法 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异 。 性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌
在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，
若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所 编码的蛋白质，则加入该蛋白质的特异抗体，可 与该菌落结合，附着在滤膜上，不会被洗掉。该 抗体可携带酶或荧光，易于检测。
• *Inserted in one direction
定向插入
• 缺点 操作比较麻烦。如果两种酶要求的条件
不同，需要进行两个阶段的反应。
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几种实验方法
• 利用相应的技术方法，使实验顺利 进行。
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末端转移酶
Link of homopolymeric tails
添加同聚尾避免质粒的自身环化
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cDNA
PCR产物
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2、Northern blot 标记探针与膜固相RNA杂交。
根据杂交信号强弱判断表达量，
根据杂交信号位置判断分子长度。
杂交信号
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实验操作：
1）RNA提取
2）RNA电泳（分离不同长度RNA)
3）转膜 (形成固相RNA)
4）探针标记（同位素/非同位素） 5）杂交 6）洗膜 7）显影（放射性/酶促反应）
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14
单酶切粘末端的双向插入
AATTC G G CTTAA G CTTAA AATTC G G CTTAA G CTTAA
AATTC G
AATTC G
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16
EcoRI
HindIII
基因克隆操作过程
不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液 。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养 液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度 在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合 适。密度过高或不足均会影响转化效率。
✓ 细菌原生质体的转化：由PEG和Ca2+介导
✓ 细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细 菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行， 内含脯氨酸和微量元素。
（3）λ噬菌体DNA的转染 ✓ 感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含
葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5。
本章主要内容
目的基因的体外重组——切与接 重组DNA分子的转化和扩增——转与增 目的基因转化子的筛选和鉴定——检
教学目的及要求
➢理解基因工程各操作步骤的原理。 ➢掌握基因工程克隆目的基因的基本操作。 ➢重点：目的基因转化子的筛选方法。 ➢应用：能够根据一定的研究目的，确定基因克隆 的策略，并设计其技术路线。
✓ 特点：电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细 胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。
（5）酵母的转化一般有以下两种方法：
➢ 利用酵母的原生质球进行转化 ➢ 利用Li+盐进行转化
（6）植物细胞的转化及其他基因转移方法
➢ 叶盘法 ➢ 电击法 ➢ 基因枪法
（7）哺乳动物细胞基因导入法
➢ 磷酸钙沉淀法 ➢ 脂质体载体法 ➢ 显微注射法 ➢ DEAE葡聚糖转染技术
✓ 转化过程中37℃温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高， 为得到较高的转化效率，应使转速小于225rpm。
8-3-基因克隆的基本过程
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
5
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
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1. 制备目的基因和相b + + -
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
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4.DNA重组体的筛选和鉴定
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
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思考题：
如 何 克 隆 p53 基 因 的 部 分 序 列 （GenBank登录号:AF136270.1）？
基因克隆的基本过程
1
基因克隆主要步骤： 制备目的基因和相关载体； 将目的基因和有关载体进行连接； 将重组的DNA导入受体细胞； DNA重组体的筛选和鉴定； DNA重组体的扩增、表达和其他研究。
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1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolyme人工合成
DNA合成过程示意图
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实验名称：基因克隆
实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、
NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；
操作步骤：
1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，
在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；
2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接
T4lages 1.0
10×T4buffer 2.0
EZ-T 1.0
目的基因8.0
DdH2O 8.0
＿＿＿＿＿＿＿＿＿
20ul
3、取100µl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下
面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；
4、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并
使转化体产生抗药性；
5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，
并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；
6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振
荡培养3h；
7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；
8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充
分混匀，-80℃保存；
实验名称：假病毒的制备
实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试
剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；
操作步骤：
1、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含氨苄（1：1000）的5ml LB 培
养基中过夜培养中，37℃，200r/min；
2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过
程中要注意防污染（在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；
3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ul BamH 1 2.5ul BamH 1 1.0ul
HindIII 2.5ul HindIII 1.0ul
BSA 5.0ul BSA 2.0ul
Buffer2 5.0ul Buffer2 2.0ul
产物20ul PET28-MS2 8.0
H2O 15ul H2O 15ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
50.0 ul20.0ul
37度3小时，
4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外
灯光下暴露太久），用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；
5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接
T4lages 1.0ul
10×T4buffer 2.0ul
PET28-MS2 4.0ul
目的片段8.0ul
DdH2O 6.0ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿
20ul
6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进
行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；
7、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状
态并使转化体产生抗药性；
8、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬
菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；
9、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃
振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；
10、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），
充分混匀，-80℃保存；
11、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含卡那霉素的5ml LB 培养基中
过夜培养，37℃，200r/min；
12、将1ml 过夜培养的菌液接种到100ml 含卡那青霉素的LB 培养基中，37℃，200 r
/min 振荡培养4 -6h 至OD 600值大约在0.6-0.8；
13、加入终浓度为1mmol/L (IPTG)，在37℃条件下，200 r /min诱导表达16h；
14、10,000 rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer 5 ml重悬菌体；<
摇床一小时>
15、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3<5>s，全程
3min，超声12<10>个循环；
16、将破碎完全的表达产物12,000 rpm，4℃，离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清
到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物，分装保存-80℃保存；
17、将得到的病毒样颗粒的双酶消化验证实验分别取4 份用NEB公司的DNaseI、
生工的RNaseA 进行消化37℃消化1h-2h
18、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶消化结果；
19、去第1次消化产物进行第2次消化37℃1h-2h（用NEB公司的DNaseI）
DNaseI 40ul
10×DNaseIBuffer 100ul
消化产物10ul
TE 850ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
1ml
20、DNaseⅠ消化后，加入终浓度为5mM的EDTA终止反应，然后65度10分钟使DNaseⅠ失活；
21、提取RNA标本后上荧光定量，检验病毒颗粒的浓度和质粒的消化情况。