葡萄糖注射液无菌检查的方法验证
盐酸溴己新葡萄糖注射液无菌检查方法研究
药品评价 Drug Evaluation 2021,18（09）
·541·
1.2无菌方法适用性试验 按批出厂检验量取样
品，先将滤器用少量 0.1% 无菌蛋白胨水溶液润湿，
使 0.1% 无菌蛋白胨水溶液顺利流出，将供试品溶
液滤入滤器，滤干并将硫乙醇酸盐液体培养基或胰
酪大豆胨液体培养基滤入滤器（每筒 100 mL），分
别加入少于 100 cfu 的试验菌，置规定温度培养箱
见表 1。
表1 培养基信息
序号
培养基
批号
来源
1
胰酪大豆胨药琼脂培养基 （TSA）
190704
北京三药科技开发 公司
3
沙氏葡萄糖琼脂培养基 （SDA）
191112
北京陆桥技术股份 有限公司
4
沙氏葡萄糖液体培养基 （SDB）
191104
北京陆桥技术股份 有限公司
5
硫乙醇酸盐流体培养基 191225
北京陆桥技术股份 有限公司
中培养，3~5 d 逐日观察。同时做阳性对照试验、
阴性对照试验、试验菌平皿菌落记数，结果见表 4
和表 5。
表4 菌落计数结果（cfu/mL）
平皿数
金黄色 葡萄球菌
大肠 埃希菌
生孢 梭菌
枯草芽 孢杆菌
黑曲霉
白色 念珠菌
1
65
88
<100
64
50
72
2
63
无菌检查验证结果
37
奥氮平
意大利
加灭菌水制成5mg/ml的溶液
直接接种法
直接接种法
38
曲安奈德
台湾泛生制药厂有限公司
直接接种法
直接接种法
39
葡萄糖注射液
葡萄糖
广州白云山侨光制药有限公司
2500ml
取原液作为供试品，滤过
金黄色葡萄球菌
薄膜过滤法
薄膜过滤法
开放式过滤器，滤膜为上海净化器材厂（生产日期2005年8月10日）
薄膜过滤法
PY220,批号：20050819，杭州泰林
57
注射用硫普罗宁钠
新谊制药股份有限公司
100mg/ml
每支加1ml灭菌注射用水溶解，直接接种至15ml/每管培养基
来自中检所抗生素网站的有关药品微生物限度检查验证结果,(因为厂家不同,生产工艺及原料来原不同,检验方法会有所差异)竟供大家参考
序号
检品名称
主要成分
生产企业
实验用量
供试液制备
敏感菌株
细菌检查
真菌检查
薄膜过滤器
1
加替沙星
加替沙星
安徽精方药业股份有限公司
3g
样品以1％的H3PO4溶液溶解，转移至400ml 0.1%蛋白胨溶液中，振摇，平均分配至三个滤筒，滤过
头孢拉定
中美上海施贵宝制药有限公司
3g
0.1%蛋白胨水溶液溶解
金黄色葡萄球菌
薄膜过滤法
薄膜过滤法
批号：20041137，上海半岛实业有限公司净化器材厂
12
注射用盐酸头孢吡肟（0.5g）
盐酸头孢吡肟
中美上海施贵宝制药有限公司
3g
葡萄糖注射液无菌检查的方法验证
葡萄糖注射液无菌检查的方法验证葡萄糖注射液无菌检查的办法验证1、样品：葡萄糖注射液，规格：500ml：25g(批号：101001)：2、办法：根据中国药典2022年版二部无菌检查中薄膜过滤办法验证。
3、仪器及用具：TXQ-LS-30SII小型真空灭菌柜（山东新华），JT2022集菌仪(杭州泰林有限公司)，APY220型全封闭无菌实验过滤培养器（杭州泰林有限公司）。
4、培养基无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基，批号：；改良马丁培养基，批号：；养分琼脂培养基，批号：；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：（均由北京三药科技开发公司生产）。
5、验证实验用菌种（第三代）：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26 003]；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63 501]；生孢梭菌（Clostidium sporogenes）[CMCC(B) 64 941]；白色念株菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98 001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98 003]；菌种均由中国生物制品检定所提供。
6、菌液制备：取经35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌的养分琼脂培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50～100cfu/ml菌悬液备用。
取经35℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6约为50～100cfu/ml菌悬液备用。
取经35℃培养18～24小时的白色念株菌改良马丁液体培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50～100cfu/ml菌悬液备用。
葡萄糖注射液(250ml：12.5g)批检验记录
收样日期：
检验依据：《中国药典》（2010年版二部P928）葡萄糖注射液
执行标准：
成品检验项目
检验操作注意事项：
1.各项检验按批准的标准操作规程操作。
2.检验员应及时填写批检验记录及仪器使用记录。
3.检验过程中发现问题，要在批检验记录内详细记录，并及时通知质检负责人或质量负责人。
4.检验结束后应及时清洁，参与检验的仪器必须在校验期内。
审核人：
XX成品生测检验记录
XX/XXXX-XXX-XXX-A（04）
无菌检查记录
检品名称：葡萄糖注射液
批号：
规格：250ml:12.5g
来源：
检品数量：
温度： ℃ 湿度： ％
检验目的：
检验日期： 年 月 日
阳性对照菌：金黄色葡萄球菌
报告日期： 年 月 日
检验依据：《中国药典》2010年版二部
1.培养基制备及培养条件
[含量测定]仪器名称： 型号：
取本品适量，在25℃时，按XX/XXX序列文件中《旋光度测定法操作规程》的方法测定其旋光度，测得的旋光度与2.0852相乘，即得供试量中含有C6H12O6·H2O的重量。
① ； ； ； 。
② ； ； ； 。
（应为标示量的96.5%～103.5%）
备注
结果判定
检验人：
复核人：
检验依据：《中国药典》2010年版二部
检验日期： 年 月 日
试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
鲎试剂
湛江博康海洋生物有限公司
细菌内毒素检查用水
湛江博康海洋生物有限公司
细菌内毒素工作标准品
湛江博康海洋生物有限公司
实验操作
药品GMP质量检查中清洁验证常见问题的矫正
药品GMP质量检查中清洁验证常见问题的矫正药品GMP 质量检查中清洁验证常见问题的矫正药监部门在日常监管及监督检查的过程中，十分重视清洁验证的合规性和有效性。
在制药工业中，通过有效的清洁手段，可以将设备中各种残留物总量降低至不影响下批产品规定的疗效、质量和安全性，从而有助于最大限度地降低药品生产过程中的污染、交叉污染以及混淆、差错等风险。
2016年至今，江苏省内《药品生产质量管理规范（GMP ）》认证、跟踪、飞检及出口欧盟原料药检查中发现的缺陷条款共6414 条，确认与验证方面645 条，约占总数10.1%。
值得注意的，涉及清洁验证的缺陷条款达96 条，占确认与验证条款数的14.9%。
本文重点对上述常见问题进行矫正分析。
1 、清洁目标物的选择及限度的确定清洁目标物即清洁验证中需关注的残留物，对于非无菌生产过程，通常包括活性成分、微生物和清洁剂；对于无菌生产过程，还加入细菌内毒素。
在原料药内控标准中，对细菌内毒素有具体要求，清洁验证也应考察细菌内毒素残留。
根据风险分析结果，也可增加其他可能存在的残留。
在检查中发现，有的企业在选择清洁目标物时，缺少充分的评估。
如某厂原料药盐酸法舒地尔洁净区玻璃反应釜的清洁验证文件中，缺少细菌内毒素控制分析数据及评估，而内控标准中对内毒素有要求；又如某厂原料药次水杨酸铋在清洁验证报告中缺少产品溶解性、化学残留物、稳定性的内容，对清洁目标物的评估不充分。
对于专用生产设备，有的企业未经必要的风险评估确定合适的清洁目标物。
如某厂口服混悬剂虽为专线生产，但化合物本身易降解为氧化型产物，且处方中添加了蔗糖等矫味剂，在清洁验证时仅作了目检，未对可能的降解产物、微生物残留进行测定考察。
1.1 活性成分清洁目标物中活性成分的确定需经过风险评估，充分考虑其溶解度、清洁难易程度、毒性和效价、稳定性等，以确定最差条件[3]。
如某厂共线生产20% 甘露醇、0.2% 乳酸左氧氟沙星、0.4% 甲硝唑等注射剂，以水为清洁剂；虽乳酸左氧氟沙星、甲硝唑属于微溶于水的化合物，但因为甘露醇注射液浓度为20%，其易结晶难洗，故选择了甘露醇作为清洁目标化合物。
脂肪乳氨基酸葡萄糖注射液无菌保证与细菌内毒素质量风险评估报告
【最新资料，WORD文档，可编辑修改】1.简介脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11％）注射液，商品名卡文，系由费森尤斯卡比集团公司研制，自2004年起由XX公司进口销售。
经费卡董事会批准XX公司接受费卡公司就该产品的技术转移，在XX公司无锡生产基地建造生产线，产品供应中国市场并出口至亚太地区市场。
项目分为生产线建设和产品注册两个相互影响的部分。
由于国内药品生产注册申请受理前要求必须具备实际的生产线并经验证生产出注册报批样品，在等待审批过程中必然存在生产设备投资的闲置问题。
由于生产设施中自动化制袋/灌装/装外袋的设备投资很大，为求得产品注册进展，项目费用、生产能力和市场需求的最优平衡，决定分两个阶段建设生产设施：第一阶段，2008年实现投资较低的进口成品空袋、半自动灌装，每小时灌装200袋的生产能力，以达到年产100万袋的产能，产品可满足国内市场需求。
但其中配制、灭菌、灯检、装箱等设备和公用工程应能为第二阶段每小时900袋的生产能力配套。
第二阶段，2010年投资一套全自动的制袋/灌装/装外袋的设备，以取代第一阶段的半自动设备，产品除满足国内市场外，还可供应亚太地区。
根据上述项目建设策略，因灌装速度的限制，会存在配制批量、灭菌能力超过第一阶段的灌装能力的问题。
主要表现为：如以1440ml规格的产品计算，脂肪乳注射液最大配制批量2000升生产，灌装时间会达到40小时；以最小批量1000升生产，则需要的灌装时间为20小时。
1920ml规格的产品灌装时间分别低于上述数据。
通常，营养类输液产品灭菌前存放时间超过12小时，应考虑灭菌前微生物繁殖导致的产品无菌保证和细菌内毒素质量的风险，并采取有针对性的措施控制风险。
而就产品的理化质量而言，只要产品灌装前和灌装后具有同样的氮气保护，相对于产品2年以上的稳定性保证，几十小时的灌装时间不会造成特殊的风险。
本文以产品的无菌保证和细菌内毒素质量风险控制为目标，通过分析药液长时间灌装导致微生物繁殖的各种风险因素，说明项目在设备与工艺设计、质量控制策略等方面采用的全面的风险控制策略与方案，并结合相应的验证和试验结果，以评估产品的实际风险控制水平。
氧氟沙星葡萄糖注射液的无菌检查进行方法学验证
10.3.6.1 试验目的：对氧氟沙星葡萄糖注射液的无菌检查进行方法学验证及对供试品进行无菌检查。
10.3.6.2 试验仪器及药品：10.3.6.2.1 试验仪器：HT-1300超净工作台净集团安泰空气技术生化培养箱医疗器械厂HTY-Ⅲ智能集菌器高得医疗器械KSF集菌培养器高得医疗器械10.3.6.2.2 供试品和试剂：10.3.6.2.2.1培养基：硫乙醇酸盐流体培养基（用于好氧菌和厌氧菌）、改良马丁培养基（用于真菌）、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基（均由中国生物制品检定所提供）10.3.6.2.2.2菌种：均由中国生物制品检定所提供菌种名称菌株编号对应培养基金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC( 26 003 硫乙醇酸盐流体培养基铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC( 10 104 硫乙醇酸盐流体培养基枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC( 63 501 硫乙醇酸盐流体培养基生孢梭菌Clostridium sporogenes CMCC( 64 961 硫乙醇酸盐流体培养基白色念珠菌Candida albicans CMCC(F) 98 001 改良马丁培养基黑曲霉菌Aspergillus niger CMCC(F) 98 003 改良马丁培养基10.3.6.2.2.3 供试品：氧氟沙星葡萄糖注射液（本公司自制）规格：100ml：0.2g，批号：0502011、0502021、050203110.3.6.2.2.4 稀释液、冲洗液及溶解液的制备：0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。
0.9%无菌氯化钠注射液取0.9%氯化钠注射液（500ml/瓶）1瓶，灭菌保存。
10.3.6.3培养基的系统适用性检查10.3.6.3.1 无菌性检查每批培养基随机取6瓶，在各自条件下培养14天，逐日观察，结果均无好氧菌、厌氧菌和真菌生长，符合无菌要求。
无菌检查方法验证报告
无菌检查方法验证报告目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 接受标准 (3)4. 抽样计划 (3)5. 设备、试剂和菌种信息 (3)6. 试验步骤 (4)7. 供试品检查 (6)8. 结论 (6)9. 再验证周期 (6)10. 附件清单 (6)1.目的支据中国药典2020版无菌检查法的要求，对产品的无菌检查法进行验证，以确定一种无菌检查的方法能有效的消除该产品对微生物的抑制作用，从而证实该方法的有效性和实用性。
2.适用范围适用于本司产品的无菌检查。
3.接受标准与阳性对照比较，含供试液各容器中的试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉）均生长良好，则可照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。
如含供试品的任一容器内的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需进一步改进检验条件再进行方法验证试验。
4.抽样计划随机抽取灭菌后的样品24份。
具体信息见表一：表一样品信息确认人/日期：复核人/日期：5.设备、试剂和菌种信息5.1设备信息详见表二表二设备信息确认人/日期：复核人/日期：5.2试剂信息详见表三：表三试剂信息确认人/日期：复核人/日期：5.3菌种信息详见表四：表四菌种信息确认人/日期：复核人/日期：5.3.1菌液的制备用接种环取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取生孢梭菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的第四代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的第三代培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
以上操作均在微生物检验室阳性菌室的生物安全柜中进行。
5%葡萄糖注射液无菌方法验证方案
卷内目录1. 5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证计划2. 5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证小组名单3. 5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证方案4. 5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证检测记录5. 5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证验证报告6. 5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证验证合格证5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证计划应公司验证委员会要求，对我公司生产的各品种进行无菌检查方法验证。
“5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证”项目验证工作计划如下：一．2008年11月1日至11月3日：制定验证方案，由注射剂无菌检查方法验证小组组长负责起草。
二．2008年11月4日至11月8日：验证方案讨论、修改、审批及培训。
三．2008年 11月9 日至11月23日：验证工作实施，主要工作内容是根据验证方案及要求完成资料准备与核查、样品准备、检验、后期的培养、观察及相关记录的填写。
四.2008年11月24日至11月26日：根据验证情况与记录，书写验证报告。
五．2008年11月27日至11月29日：验证报告审核批准，合格证书发放。
无菌检查方法验证小组2008年11月1日5%葡萄糖注射液无菌检查方法验证小组名单组长：XX成员：XXX XXX XXX1.概述我公司主要生产大容量注射剂，属于最终灭菌的无菌制剂，按照《中华人民共和国药典》（2005版）等法规要求成品必须进行无菌检查。
无菌检查对操作环境、检测用器材（器具、试管、平皿、镊子等）、培养基、设备设施要求高，检测和处理过程必须严格控制才可能得到稳定、可靠、真实的结果。
根据样品特性制定检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行药品的无菌检查;若不符合，重新建立制定检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
2.验证目的通过验证确认所采用的检验方法适合于5%葡萄糖注射液的无菌检查。
3. 验证依据3.1《药品生产验证指南》（2003版）（国家食品药品监督管理局）3.2《药品生产质量管理指南》（1998修订版）3.3《中华人民共和国药典》（2005年版二部）4.验证4.1试验前的准备a）检验环境的确认无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部100级的单向流洁净区内进行。
注射剂无菌保证工艺研究与验证及申报资料的原则性规范
（一）注射剂剂型选择的原则
注射剂：大容量注射剂（50ml以上） 小容量注射剂（20ml以下） 粉针剂（冻干、无菌分装）
不同剂型采用的灭菌工艺可能不同，进而会影响产 品的SAL（无菌保证水平），因此，在评价无菌保证工 艺时，首先应评价剂型选择的合理性
工艺验证：培养基灌装验证 无菌原料药，精、烘、包需在百级环境下进行 无菌辅料的技术要求与无菌原料药一致
五、申报资料要求
按照《药品注册管理办法》，申报资料 需提供生产工艺及验证资料 ➢ 生产工艺研究与验证内容的完整体现 ➢ 生产工艺技术评价的重要试验依据 ➢ 批准前检查、现场核查等监管的档案依据
无菌保证工艺研究与验证资料的格式和内容
决策树越往下，风险越大 需要提供的必要证据越多
基本原则:
➢ 无菌产品应在灌装到最终容器后进行最终灭 菌（首选）
➢ 如因产品对热不稳定不能进行最终灭菌时， 可采用最终灭菌方法的替代方法--过滤除菌 和/或无菌生产工艺（退而求其次）
同时明确如下要求：
➢ 无菌药品生产企业，首先应根据特定的处方选择最佳的灭菌方法， 然后再选择包装材料
简述无菌保证工艺，以及用到的灭菌设备、原理和型号 （一）原辅料、药包材的来源及质量标准 （二）原辅料、药包材的准备：原辅料的预处理、直接接
触药品的内包装材料等的清洗、灭菌等。 （三）无菌保证工艺研究与验证试验的过程及结果 （四）结论 （五）再验证（拟进行再验证的时间和内容）
无菌保证工艺研究与验证试验的过程及结果
的测定
及污染菌的耐热性测定
工艺验证要求： 过度杀灭法和残存概率法均应进行工艺验证 验证内容：空载热分布
满载热分布 热穿透试验 微生物挑战试验（残存概率法） 灭菌前微生物污染水平---数量和耐热性
葡萄糖注射液的检查
装量检查
装量检查 按照最低装量检查法检查：取供试 品3个，开启时注意避免损失，将内容物分别 用干燥并预经标化的注射器抽尽，读出每个 容器内容物的装量，并求其平均装量。
不溶性微粒 不溶性微粒的检查是可见异物检查符合 规定后，检查不溶性微粒的大小和数 量。有光阻法和显微镜计数法，除另 有规定外，采用光阻法。
其实，世上最温暖的语言，“ 不是我爱你，而是在一起。” 所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊 重，相互包容，相互懂得，才能走的更远。 相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！ 择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓 言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。 人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的 开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。 然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。 忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。 人有悲欢离合，月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪， 弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。 人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时， 你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。 岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏 识，还是成长岁月无法躲避的经历……愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。 其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使 你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能 善待自己和他人。 一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每 一个朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！
综合技能实训14 5萄糖注射液的细菌内毒素检查教案资料
1．确定检品的L值
L＝K/M
式中，L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K＝5EU/（kg·h），放射性药品注射剂K＝2.5EU/（kg· h），鞘内用注射剂K＝0.2EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。
三、学生分组完成操作，进行加样。
四、学生在老师指导下完成保温工作。
五、随机抽一名学生演示上述操作，由来自学们充当评委，指出操作不当之处。
六、根据中国药典，对检验结果进行判断。
七、老师组织组间评比，评比内容包括方案设计的合理性、操作的规范性、报告方法及检验结果的准确性等，由同学代表和老师共同综合上述各项打分。
S
供试品阳性对照
阳性对照
阴性对照
0.1ml水+0.1ml SMVD
0.1ml SMVD+0.1ml E2λ
0.1ml水+0.1ml E2λ
0.2ml水
（4）封闭管口，摇匀，放入37℃±1℃恒温水浴保温60分钟±2分钟，取出观察结果，记录结果。
将试管缓慢翻转180°，若管内凝胶显示坚实不变形为阳性，记录为“+”；若无凝胶出现，或虽有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱，均判定为阴性，记录为“－”。
4．结果判断若阴性对照溶液的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液的平行管均为阳性，阳性对照溶液的平行管均为阳性，试验有效。若检品S的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若检品S的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定；若检品S的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
灭菌无菌工艺验证指导原则
灭菌/无菌工艺验证指导原则〔第二稿〕目录1概述 (2)2制剂湿热灭菌工艺 (3)湿热灭菌工艺的研究 (3)2.1.1 湿热灭菌工艺确实定依据 (3)过度杀灭法的工艺研究 (5)残存概率法的工艺研究 (5)湿热灭菌工艺的验证 (7)物理确认 (7)2.2.2 生物学确认 (9)3制剂无菌生产工艺 (10)无菌生产工艺的研究 (10)无菌分装生产工艺的研究 (10)3.1.2 过滤除菌生产工艺的研究 (11)3.2 无菌生产工艺的验证 (12)培养基模拟灌装试验 (12)3.2.2 除菌过滤系统的验证 (14)4原料药无菌生产工艺 (17)4.1 无菌原料药生产工艺特点 (18)4.1.1 溶媒结晶工艺 (18)4.1.2 冷冻干燥工艺 (19)4.2 无菌原料药工艺验证 (19)4.2.1 验证批量 (19)4.2.2 最差条件 (19)1概述无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。
从严格意义上讲，无菌药品应完全不含有任何活的微生物，但由于目前检验手段的局限性，绝对无菌的概念不能适用于对整批产品的无菌性评价，因此目前所使用的“无菌”概念，是概率意义上的“无菌”。
一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平〔Sterility Assurance Level, SAL〕来表征。
而这种概率意义上的无菌保证取决于合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及生产过程中严格的GMP管理。
无菌药品通常的灭菌方式可分为：1〕湿热灭菌；2〕干热灭菌；3〕辐射灭菌；4〕气体灭菌；5〕除菌过滤。
按工艺的不同分为最终灭菌工艺〔sterilizing process〕和无菌生产工艺〔aseptic processing〕。
其中最终灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺，由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌药品，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此范畴。
盐酸氨溴索葡萄糖注射液无菌检查方法验证
１ 仪器与材料
１１ 试 药 ．
盐酸氨溴索葡 萄糖 注射 液 ， 规格 ：０ ｌ盐 酸氨 １０ ｍ ：
溴索 ３ ｇ与葡 萄糖 ５ｇ ０ｍ 。上海华 源安徽 锦辉 制药有 限公 司 ， 批号 １ １０ －。无 菌 ０ ９ 氯 化 钠 溶 液 （ 号 ：０ １０ １ ； １０ ８１ ．％ 批 ２ １１０ ） ０１ ．％蛋 白胨水溶液 （ 批号 ：０ １０９） 无 菌 ０ ９ ２ １ １０ ； ． ％氯 化钠 溶 液本公 司生 产。
上述各株菌 的培养物均为第三代 的培养物 。 ２ ３ 培 养基 的配制 按 中国药典 ２ １ ． ０ ０年版二部附录 Ｘ Ｈ的 Ｉ 要求分别配制各培养基及稀释液并灭 菌 ， 备用。
． Ｏ 枯草 生孢梭菌（ｉｔｄｍ ｓｏ ｇｎ） Ｃ Ｃ （ ）６９１ ； Ｓ ｓｉｕ ｒ ｅｓ ［ Ｍ Ｃ Ｂ ４４ ］铜绿假单胞菌 ２ ４ 试验用 菌液检 验 取 上述 金黄 色葡 萄球 菌 １ ～、 ｏｒ ｐｏ 芽孢杆菌 １ ～、 Ｏ 铜绿假单胞菌 １ 的稀释液各 １ｍ ， Ｏ ｌ分别用 （ｓｕｏ ｏａ 槲ｕ ｎｓ） Ｃ Ｃ Ｂ １１４ ； ｐｅｄｍ ｎｓ ｏａ ［ＭＣ （ ） ００］黑曲霉 （ｓｅ ｉ ｓ ｉ Ａ ｐｒ Ｕ — ｇ ｕ ｎ ２０ ００型蒸 发光散射检测器进行 检测 。根 据检测 结果 ， 所有 色 谱峰 的理论塔板 数均在 ３００以上 。该 方法灵 敏、 确 、 现 ０ 准 重
安 徽 医 药 Ａ ｈ ｉ ｄ ａ ｎ ｈ ｒ ａｅｔ ａ Ｊｕｎ ｌ ２ １ ｙ １ （ ） ｎ ｕ Ｍｅｉ ｌ ｄＰ ａｍ ｃｕｉ ｌ ｏｒａ ０ ２Ｍａ ：６ ５ ｃ ａ ｃ
．０ ６ ３．
盐酸氨溴 索葡萄 糖注射液 无菌检查 方法验证
葡萄糖注射液(成品)检验操作规程
GMP管理文件
一、目的：为规定葡萄糖注射液生产过程中的质量控制和检验操
作要求，特制定此操作规程。
二、适用范围：适用于葡萄糖注射液成品的检验。
三、责任者：生产部经理、检验员、生产人员
四、正文：
质量标准：见葡萄糖注射液（成品）内控质量标准
操作内容：
【性状】本品为无色或几乎无色的澄明液体;味甜.
【鉴别】取本品,缓缓滴入微温的碱性洒石酸铜试液中,即生成氧化亚铜的红色沉淀.
【检查】 PH值应为3.3～5.0
5_羟甲基糠醛精密量取本品适量(约相当于葡萄糖 1.0克),置100毫升中加水稀释至刻度,摇匀,照紫外-可见分光光度法,在285纳米和波长处测定,吸光度不得大于0.32.
重金属取本品适量(约相当于葡萄糖3克),必要时,蒸发至约20ml，放冷，加醋酸盐缓冲液（PH3。
5）2ml与水适量使成25ml，
依法检查，按葡萄糖含量计算，含重金属不得过百万分之五。
细菌内毒素取本品，依法检查，每1ml中含内毒素量应小于0.5EU。
其他应符合注射剂项下有关的各项规定。
【含量测定】精密量取本品适量（约相当于葡萄糖10g），置100ml 量瓶中，加氨试液0．2ml(10%或10%以下规格的本品可直接取样测定),加水稀释至刻度,摇匀,静置10分钟,依法测定旋光度,与2.0852相乘,即得供试量中含有C6H12O6.H2O的重量(g)。
葡萄糖注射液的无菌检查
葡萄糖注射液的无菌检查一、实验说明《中国兽药典》葡萄糖注射液项下规定对其进行无菌检查时，采用薄膜过滤法，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查，应符合规定。
通过本实验的训练，初步掌握无菌检查的操作技能。
二、仪器与试剂（1）恒温培养箱及生化培养箱，恒温烘箱、高压蒸汽灭菌器，开放式或封闭式薄膜过滤器（滤膜孔径应不大于0.45 μm，直径约为50 mm；根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质；滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌；使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性）。
（2）无菌室应准备好盛有消毒用5%甲酚或其他适宜消毒溶液的玻璃缸、乙醇灯、火柴、镊子、75%乙醇棉、碘伏棉等。
（3）玻璃器皿试管，量筒，三角瓶，移液管，刻度吸管（1、5、10 mL），注射器（2、5、10 mL），双碟等。
（4）无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌待用或用一次性的无菌物品代替。
（5）试剂葡萄糖注射液，0.9％无菌氯化钠溶液，pH 7.0 NaCl-蛋白胨缓冲液，硫乙醇酸盐流体培养基，改良马丁培养基，金黄色葡萄球菌对照菌悬液。
三、检查方法按检验数量的有关规定选择一定数量的样品，取供试品（装量10 mL）最少检验数量10支，另增加5支作为阳性对照用。
将供试品外表面经过适宜的方法消毒处理后，直接通过装有孔径为 0.45 µm 的一般薄膜过滤器过滤，或加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶液（至少100 mL）中，混合后，立即通过装有孔径不大于 0.45 µm的薄膜过滤器，然后用pH 7.0 NaCl-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜至阳性对照菌正常生长。
每次冲洗量一般为100 mL，冲洗次数一般不少于3次。
冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100 mL硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基加入相应滤筒内；如采用一般过滤器，则取出滤膜分成3等份，分别加入含50 mL上述两种培养基中，按规定温度和时间培养。
无菌检查法 葡萄糖注射液的无菌检查(药品生物检定技术课件)
七、方法学验证试验
直接接种法 取硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别两两接入小于100cfu
的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭 菌；另取改良马丁培养基4管，分别两两接入小于100cfu的 白色念珠菌、黑曲霉。两相同菌种管中，1管接入规定量的 供试品，另1管作为对照，置规定温度培养3～5天。
供试品最少检 验数量（瓶或
支） 10① 10 10 10②
10
10①
10
整个器具③（切碎 或拆散开）
10①
八、供试品的无菌检查
（二）阳性对照和阴性对照
阳性对照
无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品 金黄色 葡萄球菌为对照菌 抗革兰阴性菌为主的供试品 大肠埃希菌为对照菌 抗厌氧菌的供试品 生孢梭菌为对照菌 抗真菌的供试品 白色念珠菌为对照菌。
无菌检查是根据某批产品中部分样品的抽检结果， 推断整体的灭菌情况，涉及统计学方法的应用。
例如，在一批药品中，染菌部分占10％，任抽取一份样品
，其染菌概率为取P＝样0.数1，量未增染菌加概，率q＝1－0.1＝0.9，任抽取 该批药品通过
两份样品，都染菌无的菌概检率为查P2的＝概0.01，均未染菌的概率为q＝ （1－P）2＝0.81。检率查降时低，若！取n个样品，则均无菌的概率为
• pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 稀释液
• 聚山梨酯80-0.1%蛋白胨水溶液 非水溶液制剂供试品的冲洗
• 十四烷酸异丙酯 膏剂和粘性油剂的溶剂
七、方法学验证试验
何时须进行方法学验证 当供试品为新的产课品堂时互动：培养基适 当供试品的组分、用检性验检条查件中发也生用到改了变时
验证用菌株：金黄色葡6种萄标球准菌菌、株大，和肠方埃希菌、枯 草芽孢杆菌、生孢梭菌法、学验白证色所念要珠用菌到、的 黑曲霉
无菌检查标准操作规程
无菌检查标准操作规程无菌检查法是检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。
事实上，若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。
无菌检查法有薄膜过滤法、直接接种法两种方式。
细菌培养温度32.5℃±2.5℃，真菌培养温度25.5℃±2.5℃。
1 无菌检查的环境无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可考性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。
无菌检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向留空气区域内或隔离系统中进行，其全过程笔削严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。
面积一般不超过10m2，不小于5m2；高度不超过2.4m。
由1～2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。
在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间内不应安装下水道。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18～26℃，相对湿度45%～65%。
缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。
无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。
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葡萄糖注射液无菌检查的方法验证
1、样品：
葡萄糖注射液，规格：500ml：25g(批号：101001)：2、方法：
按照中国药典2010年版二部无菌检查中薄膜过滤方法验证。
3、仪器及用具：
TXQ-LS-30SII小型真空灭菌柜（山东新华），JT2010集菌仪(杭州泰林有限公司)，APY220型全封闭无菌试验过滤培养器（杭州泰林有限公司）。
4、培养基
无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基，批号：；改良马丁培养基，批号：；营养琼脂培养基，批号：；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：（均由北京三药科技开发公司生产）。
5、验证试验用菌种（第三代）：
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26 003]；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63 501]；生孢梭菌（Clostidium sporogenes）[CMCC(B) 64 941]；白色念株菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98 001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98 003]；菌种均由中国生物制品检定所提供。
6、菌液制备：
取经35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌的营养琼脂培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50～100cfu/ml菌悬液备用。
取经35℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6约为50～100cfu/ml菌悬液备用。
取经35℃培养18～24小时的白色念株菌改良马丁液体培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50～100cfu/ml菌悬液备用。
取经25℃培养一周的黑曲霉改良马丁斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液
10ml，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液，用垫有脱脂棉的漏斗（湿热灭菌）过滤，除去菌丝，收集菌液至另一无菌试管内作为菌原液，取此菌原液0.1ml加入到0.9%无菌氯化钠溶液至9.9ml中，稀释至10-5约为50～100cfu/ml孢子悬液备用，同时进行菌液计数。
各菌液计数结果见表1。
表1细菌和真菌计数结果（菌数为2个平皿的平均数cfu/ml）
7、验证试验：
7.1薄膜过滤法：
取规格为每支装10ml的供试品2支，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，按薄膜过滤法全量过滤，在约50ml的0.9%无菌氯化钠溶液中加入少许100cfu试验菌，同法过滤，将100ml相应的培养基加至封闭式薄膜滤器中，作为一株菌的供试品管。
同法制备其它5株菌所用的供试品管，按规定的温度培养3～5天，每天观察并记录结果。
规格为每支装2ml的样品除取用量为5支外，其他操作同上。
7.2菌液对照：
另取封闭式薄膜过滤器，不过滤供试品，其它操作同上（同法加入等量的试验菌），作为菌液对照管。
6种试验菌分别同法操作，按规定的温度培养3～5天，每天观察并记录结果。
7.3阴性对照：
两个滤器内过滤0.9%无菌氯化钠溶液各200ml，然后分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100ml，不加对照菌液，分别培养。
7.4培养：
硫乙醇酸盐流体培养基置35℃培养；改良马丁培养基于25℃培养。
8、验证试验结果：
供试品管及菌液对照管见表2，阴性对照管在规定时间内没有菌长出。
表2 香丹注射液无菌检查验证试验结果
9、结论：
根据上述验证结果，本品香丹注射液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念株菌、黑曲霉无抑菌作用，其无菌检查应按照中国药典2005年版一部无菌检查法（附录XIII B）中的薄膜过滤法进行，不需冲洗，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。
10、无菌检查法：取本品，按中国药典2005年版一部无菌检查法（附录XIII B）中的薄膜过滤法检查，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，应符合规定。
湖北省药品检验所
2008年2月
湖北清大康迪药业有限公司
2009年3月25日。