发酵法制取植酸酶的研究

摘要: 以麸皮为主要原料, 添加少量稻 壳以增加疏松度, 加入与物料同重 量的水, 混匀, 经灭菌、冷却 后, 接 种诱变后的 黑曲
霉 3. 324菌株。采用曲盘固体发酵法, 在保持室温 28- 30 e , 干温相差 1 e 的条件下 发酵 6 d, 经生化方法提纯得到植酸酶
精制品, 每克干曲 (以麸皮原料计算 )产植酸酶约 0. 145 g, 精制品植酸酶活力达 300 U# g- 1。
植酸酶是新型动物饲料添加剂的重要酶制剂, 它对提高饲料中磷利用率, 提高动物的生产性能, 以及 减轻高磷粪便对水域磷污染有重要意义。植酸酶是一类水解酶, 由于化学结构不同, 分为 2类: 3-植酸酶 和 6-植酸酶。 6-植酸酶最适 pH 为 5. 0- 7. 5, 动物小肠的 pH 约 5. 5, 主要在小肠中起作用, 在单胃动物胃 酸 ( pH 为 2. 5) 环境中不起作用。 3-植酸酶在酸性条件下, 有较高酶活性, 最适 pH 为 2. 5 - 5. 5, 在单胃动 物的胃环境中, 能迅速将植酸磷 ( 六磷酸肌酸 ) 降解为肌酸和无机磷, 便于动物吸收利用, 被认为是目前最 具有应用前景的饲用植酸酶 [ 1] 。
粉碎 y 制粒 y粗酶制品 (粗品 )
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酶粉 ( 精品 ) z 粉碎 z 干燥 z 沉淀 z 提取母液体
1. 5 黑曲霉菌种子培养 按 4B1B4的质量比称取麸皮、面粉和水, 混合均匀后用筛子将粗粒筛去, 将曲料装入 300 mL 锥形瓶
中, 装入厚度以 1 cm 左右为准。锥形瓶塞上棉花塞后, 用蒸汽加压灭菌, 于 1. 05 kg# cm- 2维持 30 m in。 灭菌后趁热将曲料摇松, 待冷却后, 在超净台上接入试管黑曲霉原种, 摇匀后置于 30 e 恒温培养箱内, 培 养 18 h左右。待曲料已稍发白结饼时摇瓶 1次, 将结块摇碎。继续置于 30 e 恒温箱内培养 4 h源自文库右, 待 曲料发白结块时再摇瓶 1次。培养 2 d后, 把锥形瓶轻轻地倒置过来, 继续培养 1 d, 等曲料全部长满黑褐 色的孢子, 即可使用。
1. 3 设备 设备有恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、可调温调湿曲房、曲盘架、烘干房、粉碎机、S53 / 54
型分光光度计、A gilent 3510型火焰分光光度计等。
1. 4 工艺流程
工艺流程图 [ 3] 如下。
试管斜面菌 y锥型瓶种子培养 ( 接种 ) y 曲盘 y 高温灭菌 y 冷却 y 曲盘培养发酵 y 固形物 y 干燥 y
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亚热带农 业研究
第 2卷
1. 7 曲盘接种 待曲料冷却至 40 e 左右, 接入黑曲霉锥形瓶扩大培养纯种。用量为总料的 0. 5% - 1% , 均匀翻拌, 使
黑曲霉菌分生孢子广泛分布于曲料上。
1. 8 曲盘培养、发酵 曲料接种完毕后装入曲盘内并轻轻摊平, 曲料的厚度约 2 cm。曲盘长 45 cm, 宽 35 cm, 四周边框高 5
1. 9 植酸酶粗制品的制备 曲盘固体发酵完毕, 新鲜的植酸酶含有较多的水分, 不能长久储藏, 出盘后应及时摊凉, 以防发热变
质。为了便于贮存, 必须用热气流烘干曲盘 ( 夏天可采用薄层凉干或日光曝晒 ), 干燥温度为 40 e 左右, 不宜超过 45 e , 中间要勤翻拌, 烘到水分达 10% 以下, 即可取出。使用锤式粉碎机粉碎, 粉末过筛 ( 筛孔 直径为 0. 8 mm ), 取样测定酶活力后即可包装。
1. 8% 琼脂, 加水至 100 mL, pH 自然。 具体操作方法: 将蔗糖先用少量水调和, 然后倒入所需的水, 再逐一加入硝酸钠、硫酸镁、磷酸氢二钾
和硫酸亚铁, 待全部溶解后, 加入琼脂加热并不断搅拌, 至琼脂完全融化后停止加热, 趁热装入试管, 塞上 棉塞, 包扎后灭菌, 于 1. 05 kg# cm- 2维持 20 m in, 取出斜置, 冷却凝固成斜面试管。检查无菌后于无菌室 接种黑曲霉菌, 置于 30 e 恒温箱中培养 3- 4 d, 待培养基表面长满黑褐色孢子后取出备用。
( 1. Co lleg e o f B io logy and Env ironm enta l Sc iences, Zhe jiang W anliU n iversity, N ingbo, Zhe jiang 315100, Ch ina; 2. Guanhaiwe i Instruction Station of C ix ,i Zhejiang A g ricu ltura l Correspondence Co llege C ix ,i Zhe jiang 315315, China)
Abstrac t: U sing of bran as m a in raw m ater ia,l and a low amoun t o f rice hu llw as added to increase the sed imentation of raw m ater-i a ls. The same amoun t o f wa ter w asm ix ed equa lly w ith the raw m ater ia ls. A fter sterilizing and coo ling, the asperg illus n ig er w as inoculated to the processed m ater ia ls. A so lid ferm enta tion at the temperature o f 28- 30 e , and tem perature difference of 1 e w as emp loyed and lasted fo r 6 days. T he amoun t of produced phy tase w as 0. 145 g per kg, and the enzym e activ ity o f pur ified phya tse w as detected at a leve l of 300 U# g- 1. K ey word s: ferm en tation; phytase
植酸酶对单胃动物的饲喂效果已在国外得到广泛的肯定。自 1991年荷兰首次在畜禽饲料中使用植 酸酶以来, 植酸酶的应用一直是饲料工业的热点。目前植酸酶代替无机磷应用于养殖业已具规模。据报 道, 仅 1999年全球经植酸酶处理的饲料就达 5500万吨。植酸酶使用效果主要表现为如下 2个方面 [ 1- 2 ] 。 ( 1) 提高植酸磷的利用率。磷在植物中主要存在形式为植酸磷, 植酸磷不能被单胃动物直接利用, 随粪便 排出体外。若饲料中添加植酸酶, 植酸酶能促使植酸磷降解为肌酸和无机磷, 代替饲料中必须添加的无机 磷成分, 提高植酸磷的消化率, 并减轻养殖业带来的磷污染, 保护环境。 ( 2)消除植酸对矿物元素和蛋白 质的抗营养作用。植酸有很强的络合力, 能与饲料中蛋白质, 锌、钙、锰等无机盐离子和维生素等合成稳定 的复合物, 从而降低这些营养成分的利用。植酸酶水解植酸, 破坏了它对矿物元素和蛋白质的络合能力, 使被络合的矿物元素大量释放出来, 同时由于植酸 ) 蛋白质络合之间的键断裂, 也可使蛋白质从络合物中 释放出来, 从而提高饲料中矿物元素和蛋白质的利用率, 提高畜禽生产性能。
关键词: 发酵法; 植酸酶
中图分类号: Q 55
文献标识码: A
文章编号: 1673-0925( 2006) 02-0138-04
A study of phytase preparation by ferm entation
WANG C a-i sheng, SH I Ke-you, ZHANG Shun- feng
cm, 底板背面横钉 1 cm 厚的木条 3根。在可调温曲房里, 曲盘先用直立式堆叠, 室温维持在 28- 30 e , 干 温相差 1 e , 培养 16 h左右。当品温达到 32 e 时, 曲料面层稍有发白结块, 并产生一股曲香味 ( 似枣子 味 ) 时, 进行第 1次翻曲。翻曲时将曲块用手捏碎并轻轻拌和、摊平, 盖上湿纱布一块, 使曲料与空气不直 接接触。然后将堆叠方式改为十字形堆叠, 室温继续维持在 28- 30 e , 4- 6 h后, 当品温上升到 34 e 时, 进行第 2次翻曲、拌和、摊平。最后是发酵产酶阶段, 室温维持在 28 e 继续发酵 5 d。
亚热带农业研究 Subtrop ica lA g ricu lture R esearch
第 2卷 第 2期 2006年 5月
发酵法制取植酸酶的研究
汪财生 1, 施可友 2* , 张顺凤1 ( 1. 浙江万里学院生物与环境学院, 浙江 宁波 315100; 2. 浙江农业函授大学慈溪市观海卫辅导点, 浙江 慈 溪 315315)
1. 10 植酸酶精制品的制备 1. 10. 1 提取母液 植酸酶溶于水及乙醚, 不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙脂及含有氯的烷烃。将一定量的麸 曲加入 3- 4倍温水 ( 40 e 左右 ) , 浸泡 3 h。 1. 10. 2 压滤 将浸泡的麸曲连同浸泡液一起装入绒布袋, 扎紧口袋, 用螺旋压榨机压榨, 将酶液压出 (可 重复浸泡 )。 1. 10. 3 调节酶液 pH、离心 将上述反复浸提的酶液合并, 调节 pH 至 5. 5- 6. 0, 静置 0. 5 h, 置于离心机 离心, 除去与酶无关的杂质, 取其上清酶液。 1. 10. 4 乙醇沉淀 先将上清酶液和 68% - 70% 乙醇分别冷却降温至 10 e 以下, 然后将乙醇倒入上清酶 液, 边倒入边搅拌, 随之静置 2. 5 h, 使沉淀完全。 1. 10. 5 分离、洗涤 于 3000 r# m in- 1离心沉淀 15 m in左右, 取沉淀 ( 即植酸酶泥 ) 。用 95% 乙醇洗涤 2 - 3次, 以去除水分。 1. 10. 6 干燥、粉碎、包装 在室温下真空干燥 15- 20 h, 干燥后用粉碎机粉碎成粉末状, 色泽呈浅黄色。 用塑料袋密封包装, 放置低温干燥处保存。
1. 6 曲料配制及灭菌 1. 6. 1 配制 曲盘固体发酵的主要原料是麸皮、稻壳和水, 麸皮、稻壳和水按 9B1B9- 9. 5比例调配, 再添 加少量的无机氨和其它无机盐。先称取麸皮和稻壳, 用拌和机拌匀, 再加水 ( 含 0. 1% 硝酸钾 ) 充分拌匀。 应视原料性质控制水量, 尚需凭借经验, 一般用手轻轻地揉捏使原料成团, 再用手指一弹, 即能散开为宜。 1. 6. 2 灭菌 采用常压蒸煮的方法。在蒸锅上放一块有许多直径为 0. 3 cm 小孔的不锈钢挡板, 待锅内水 烧开时, 将曲料松散地撒在挡板上, 等冒出蒸汽再加第 2层, 何处蒸汽足就把剩余曲料撒到此处, 如此逐步 加入, 直至曲料撒完后加盖蒸煮 1 h, 焖 30 m in, 出锅过筛, 移入拌和台上摊开、翻拌, 使之快速冷却。
1 材料与方法
1. 1 生产原料 新鲜、干燥、疏松和无结块霉烂的麸皮购于宁波市饲料公司; 新鲜、干燥, 无霉烂的稻壳购于宁波市鄞
州区邱隘米厂。
1. 2 发酵菌种 黑曲霉 3. 324菌株购于中国科学院。菌株经紫外线诱变选育, 能分泌 3-植酸酶型的植酸酶。该菌生
长发育过程由白色变黄色, 然后由黄色变黑褐色, 具有抗酸、抗高温、喜潮湿的特性。 斜面试管培养基配方: 3% 蔗糖、0. 2% 硝酸钠、0. 05% 硫酸镁、0. 001% 硫酸亚铁、0. 1% 磷酸氢二钾、
植酸酶广泛存在于植物和微生物细胞中, 植酸酶的生产方法目前主要采用直接从植物中提取, 但由于
收稿日期: 2006 - 02- 18 作者简介: 汪财生 ( 1969- ) , 男, 实验师。研究方向: 畜禽养殖。 * 通迅作者。
第 2期
汪财生等: 发酵法制取植酸酶的研究
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含量太少, 难以生产, 况且植物中的植酸酶是 6-植酸酶型, 作为添加剂, 对单胃动物应用商业意义不大。 通过微生物发酵, 获得大量微生物细胞, 从中提取植酸酶, 这 种植酸酶是 3-植 酸酶型, 有 很高的使用价 值 [ 1] 。据报道, 国内采用基因工程技术, 构建植酸酶高效表达菌株, 已开发出用酵母表达植酸酶的基因工 程菌, 但生产成本昂贵。因此为了降低植酸酶生产成本, 有利于植酸酶的推广应用, 本课题组采用固体发 酵法制取提纯植酸酶, 获得初步成果。