环境生物学试验教案

实验一污染物对生物在生物化学和分子水平上的影响——空气中SO2对植物叶片叶绿素含量及叶绿素a、b含量比例的影响[实验目的]（1）掌握植物叶绿素含量的测定方法（2）了解SO2对植物叶绿素含量的影响[实验原理]（1）用丙酮提取叶绿素（2）叶绿素a、b的最大吸收峰分别位于663nm和645nm，根据Lambert-Beer定律，可得：C a（mg/L）= 12.7D663 － 2.69D645C b（mg/L）= 22.9D645 － 4.68D663式中：C a、C a为叶绿素a、b的浓度。

将C a与C b相加即得叶绿素总量C T：C T（mg/L）= C a + C b = 20.21A645 + 8.02A663按下列公式计算叶绿素在叶片中的含量，并计算叶绿素a、b的比例。

mg/g⨯⨯叶绿素浓度提取液最终体积稀释倍数叶绿素含量（）=叶片鲜重克数[实验器材]（1）仪器设备：分光光度计；电子天平；研钵；剪刀；50mL棕色容量瓶；小漏斗；玻璃棒；定量滤纸；吸水纸；滴管；2mL移液管；50mL烧杯。

（2）试剂：丙酮，80%丙酮，石英砂，碳酸钙粉。

（3）实验材料：经SO2熏气和未经熏气的植物样品[实验步骤]（1）分别剪取两种处理植物的叶样，洗净，擦干，除去中脉，称取0.5g，剪碎。

（2）将剪碎的叶样置于研钵中，加少许石英砂和碳酸钙，再加少许丙酮，磨成匀浆。

再加15 mL左右丙酮，搅拌，静置3min。

（3）将提取液过滤至50mL棕色容量瓶中，多次洗涤研钵、研棒。

（4）用滴管吸取丙酮，将滤纸上的叶绿素全部洗入容量瓶。

用丙酮定容至50mL，摇匀。

（5）分别取2mL叶绿素提取液和2mL80%丙酮于50mL烧杯，混匀，成比色液。

（6）比色液用1cm的比色杯，以80%丙酮为空白对照，测定波长在645nm 和663nm处吸光度。

[实验结果]根据实验数据，比较污染植物和对照植物的叶绿素总量及叶绿素a、b比值有何差异，并加以讨论。

[注意事项]操作应在弱光下进行，且研磨时间应尽量短些，以避免叶绿素光分解。

实验二污染物对生物在个体水平上的影响——藻类急性毒性试验[实验目的]（1）掌握藻类急性毒性试验的方法（2）了解毒性试验在有害物质的生态影响评价中的应用[实验原理]藻类是水生生态系统中最重要的初级生产者，影响藻类生长的主要因子包括光、二氧化碳、温度、pH值及氮、磷、微量元素等营养成分。

水环境中的这些生态因子的变化会刺激或抑制藻类的生长。

而有毒有害的化学物质进入水体，同样会刺激或抑制藻类的生长。

低浓度短时间的接触可能会刺激藻类的生长，但随着污染物浓度增加，接触时间延长，最终都会抑制藻类生长。

污染物毒性越强，抑制效应需要的剂量越小。

因此，可以用半数效应浓度指示污染物的毒性，评价污染物对水生生态系统的影响。

因此，藻类急性毒性试验一方面可以用来评价化学物质的毒性，另一方面可以用来评价化学物质对水生生态系统的影响。

所以，水生生态系统藻类毒性试验已经成为许多国家水环境质量监测的标准方法之一。

藻类生长状况的观察采用生物量指标，生物量测定采用光密度法。

[实验器材]（1）仪器设备：恒温水浴；分光光度计；照度计；pH试纸；灭菌锅；三角瓶；移液管；量筒；烧杯。

（2）实验材料：受试物：Cd2+试验生物：斜生栅藻Scenedesmus obliguus （3）培养基[实验步骤]（1）藻类培养基的配制按配方配制，高压灭菌后分装在三角瓶中。

（2）藻类预培养准备试验藻种，包括接种、纯化、同步等过程。

（3）预备试验预备试验的目的在于探明受试物抑制藻类生长的半数效应浓度（EC50）的范围，以确定正式试验的浓度系列，因此，处理浓度的间距要大一些，使EC50值能在处理浓度的范围内。

（4） 正式试验①试验浓度的选择。

根据预备试验的结果，取5个受试物浓度，另设1个空白对照。

Cd 2+：0，10，25，50，100，150，单位mg/L 。

各20mL 。

试验溶液以培养基配制和稀释。

②藻种的接种。

取达到同步生长的藻类悬液充分摇匀，取20mL 转移到受试 物溶液中。

③生物量的测定。

采用分光光度计在波长663nm 处直接测定藻类的吸光度。

应定时取样测定藻类的生长情况。

初始测定控制起始生物量的一致；一般为24或48h 取样一次；96h 取样测定受试物对藻类生长抑制的EC 50值，即与对照相比，生长率下降50%的受试物浓度。

[实验结果和报告]（1）计算Cd 2+抑制斜生栅藻生长的EC 50值。

藻类生长抑制率 = n V V V 空白空白式中：V 为各浓度藻类生物量（吸光度）以内插法计算96h EC 50。

（2）分析思考藻类急性毒性试验的应用。

实验三生物对污染物的吸收和蓄积——植物叶片含氯量的测定[实验目的]（1）掌握叶片含氯量测定的一种方法（2）了解生物体内污染物含量测定的应用[实验原理]植物叶片能够吸收氯气，使其含氯量发生变化，这种变化与大气中氯气污染程度有一定的相关性。

因此，可以通过叶片含氯量的测定来估测氯气污染程度，判别氯气对植物的危害，进行环境质量的生物学评价，同时也可了解各种植物吸收和净化氯气的能力，筛选净化植物。

植物叶片含氯量的测定方法有多种，本实验采用水浸提法提取氯化物后，直接用佛尔哈德（Volhard）法（沉淀滴定）测定。

在酸性溶液中，以硝酸银溶液及硫氰酸盐溶液作标准液，用铁铵矾作指示剂，可直接或间接测定氯化物。

其反应过程可用下式表示：Cl-（试液）+ Ag+（过量）AgCl↓+ Ag+（剩余量）Ag+（剩余量）+ CNS-（极微过量）AgCNS↓+ CNS-（极微剩余量）CNS-（极微剩余量）+ Fe3+（指示剂）Fe(CNS)3（血红色）[实验器材]（1）仪器设备：电热板；振荡器；植物粉碎机；烘箱；容量瓶；滴定管；三角瓶；试剂瓶；移液管；干燥器。

（2）试剂：0.01N NaCl标准液；0.01N KCNS溶液；高铁指示剂；1︰1 HNO3溶液；4N HNO3溶液；高锰酸钾饱和溶液；硝基苯。

（3）实验材料：Cl2熏气叶片和对照叶片。

[实验步骤]（1）硝酸银溶液的标定吸取0.01N硝酸银溶液20 mL于150 mL三角瓶中，加4N HNO3 5mL及高铁指示剂1mL，用近似0.01N KCNS溶液滴定，在不断振摇下至溶液呈微红色为止。

滴定3次，计算1mL KCNS溶液相当于硝酸银溶液的mL数（K）。

准确吸取0.01N NaCl标准液20mL于150mL三角瓶中，加4N HNO3 5mL，缓缓加入一定过量的0.01N硝酸银溶液25mL，用力摇动，使沉淀凝结沉降，上层溶液呈透明（若溶液混浊，则硝酸银不足），放暗处几分钟后取出，加3mL硝基苯及1mL高铁指示剂，用0.01N KCNS溶液滴定，用力摇荡，待溶液全部呈微红色时，小心轻摇，至溶液呈微红色在1～2min内不消失，即达终点，滴定3次。

由消耗的硫氰酸钾溶液的mL 数，按下式计算硝酸银溶液的当量浓度。

325NaCl NaCl AgNO KCNSN V N K V ⨯=-⨯ 式中：25：所加硝酸银溶液的mL 数；K ：1mL KCNS 溶液相当于硝酸银溶液的mL 数；V KCNS ：滴定时消耗的KCNS 溶液的mL 数。

（2）实验材料处理烘干样品用小型粉碎机粉碎，称取2g 于250mL 具塞三角瓶中，加蒸馏水100mL ，在振荡器上振摇20min ，浸提一夜。

（3）滴定过滤浸提液于100mL 烧杯。

吸取滤液20mL 于三角瓶中，准确加入0.01N 硝酸银溶液20mL （若样品含氯量过高，可增加体积）和1︰1 HNO 3 10mL ，在电热板上加热（温度不宜过高），滴加饱和高锰酸钾并不时摇动，直到瓶中颜色褪尽为止。

取下放暗处冷却。

加3mL 硝基苯和1mL 高铁指示剂，用0.01N KCNS 溶液滴定，用力摇动，待溶液全部呈微红色时，小心轻摇，直到溶液的微红色在1～2min 内不变为止。

（4）计算3335.455/AgNO AgNO V N Cl mg g G -⨯⨯⨯⋅=样品含氯（）量（干重）式中：V AgNO 3：参加反应的硝酸银溶液的实际用量，mL （根据计算出的1mLKCNS 溶液相当于硝酸银溶液的mL 数（即K 值），计算参加反应的硝酸银溶液的实际用量，即20 － K × V KCNS ）；N AgNO 3：硝酸银溶液的当量浓度；35.45：氯的毫克当量值；5：换算倍数；G ：样品干重，g 。

[实验报告]比较2种处理样品含氯量的区别；分析植物叶片含氯量测定的应用。

[注意事项]（1）实际测定时，需进行平行样品含氯量的分析，取其均值。

（2）在滴定过程中，先后生成AgCl 和AgCNS 二种沉淀，由于AgCNS 的溶解度小于AgCl ，AgCl 有转化成AgCNS 的倾向，消耗了过多的CNS -。

为此，在滴入KCNS 溶液前可加入硝基苯，摇动后，AgCl 沉淀被硝基苯所包围，不再与CNS -接触，这样可得到正确的结果。

（3）AgCl 在日光照射下极易分解而析出金属银，实验注意避光。

实验四环境质量生物监测——校园河流水生生物群落监测（浮游生物调查）[实验目的]（1）了解并掌握浮游生物调查的方法（2）了解浮游生物指标在水质监测、水环境质量评价中的应用[水生生物监测布点方法]根据监测目的，考虑布点的代表性、整体性、与理化测点的一致性等因素。

1. 河流布点断面布设法（1）至少设置上（对照断面，排污口上方）、中（污染断面，污水与河水充分混合的河段）、下（观察断面，调查河段的下端）三个断面，中、下端之间可增设断面。

（2）每个断面的采样点数目根据河流宽度确定，一般河宽在50m以内时，仅布设河心一个采样点，50～100m则设置左、中、右三个采样点（或左、右二个采样点）。

如调查河段中有较多排污口时，应当在各排污口下方增设采样点。

2. 湖泊（水库）布点一般应包括五个方面：（1）入、出湖（库）河流汇合处（2）主要点源排污口（3）湖心区、深水区（4）不同功能区（5）相对清洁区也可用方格布点法设点[浮游生物调查]浮游生物、底栖动物、水生植物和鱼类可单独或联合应用于水质监测。

不同水生生物类群，采集和处理方法不同。

1. 浮游植物的采集和处理（1）主要用具及试剂25号浮游生物网；采水器（1L）；采样瓶（1000 mL）；广口瓶（200mL）；虹吸管；量杯（1000 mL，用作沉淀器）；容量瓶（50mL）；计数框；小吸管；显微镜或解剖镜；甲醛；鲁哥氏固定液（配方：碘40g，碘化钾60g，加蒸馏水1000mL）。

（2）定性样品的采集用25号浮游生物网（网眼孔径0.05～0.64 mm）在水面下（或0.5m深处）以“∞”字形缓慢拖动约3min，取出放入标本瓶，用鲁哥氏液固定（1L水样加入15mL），贴上标签保存待检。