第二章 动物细胞大规模培养和专用生物反应器

目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。 ●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。 ●适用于所有类型细胞。
灌注培养
3、贴壁培养的缺点：
与悬浮培养法相比， ●扩大培养比较困难，投资大； ●占地面积大； ●不能有效监测细胞的生长；
4、细胞贴壁的表面：
培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，
细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始 有丝分裂，并很快进入对数生长期。 一般数天后就铺满培养表面，并形成 致密的细胞单层。
贴壁培养细 胞转瓶机
2、贴壁培养的优点：
●容易更换培养液：细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。 ●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的
●可进行多次收获；
●细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在 一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。 优点：操作简便，生产效率高，可长时期进行生 产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一 直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生 产中被广泛应用。
四、连续式培养（continuous
culture）
二、悬浮培养（suspension culture） 指细胞在反应器中自由悬浮生长的过 程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养， 如杂交瘤细胞等，是在微生物发酵的基 础上发展起来的。
悬浮培养瓶
小规模悬浮培养
无血清悬浮培养
• 用已知人源或动物来源的蛋白或激素代
替动物血清的一种细胞培养方式，它能
减少后期纯化工作，提高产品质量，正
1、吸附法: 用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使 细胞固定化的方法称为吸附法（adhesion）。 操作简便、条件温和、是动物细胞固定化中 最早研究使用的方法。 缺点：载体的负荷能力低，细胞易脱落。 微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表， 稍后专门介绍。
2、共价贴附法: 利用共价键将动物细胞与固相载体结合 的固定化方法称为共价贴附法 （attachment by covalent bonding）。 此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试 剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致 扩散限制小，细胞得不到保护。
规模逐渐扩大, 发展至今已成为生物、医 学研究和应用中广泛采用的技术方法(生产 酶、生长因子、疫苗和单抗等)。
利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占
世界生物高技术产品市场份额的50% 。
• 发展：在过去几十年来，从使用转瓶(roller
bottle) 、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生 物反应器（Bioreactor）进行大规模细胞培养。
种细胞准备的一条途径。细胞
接种在旋转的圆筒形培养器— —转瓶中，培养过程中转瓶不
断旋转，使细胞交替接触培养
液和空气，从而提供较好的传 质和传热条件。
转瓶机
转瓶培养的优、缺点
优点：
结构简单，投资少，技术 成熟，重复性好，放大只 需简单的增加转瓶数量等。
缺点：
劳动强度大，占地空间大，单 位体积提供细胞生长的表面积 小，细胞生长密度低，培养时 监测和控制环境条件受到限制。
问题
上节课我们学了什么？
生物反应器
• 生物反应器的一些概念 • 生物反应器的基本类型
第二章 动物细胞大规模培养和专用 生物反应器
• 学时：2节课 • 主要内容： 常用培养方法 动物细胞培养的操作方式 细胞培养过程的放大 动物细胞培养生物放大器
相关知识介绍
• 动物细胞培养开始于上世纪初1962年, 其
口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、 脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒 疫苗、巨细胞病毒疫苗、α及β干扰素、血纤维 蛋白溶酶原激活剂、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促红细胞 素、松弛素、生长激素、蛋白C、免疫球蛋白、 尿激酶、激肽释放酶及200种单克隆抗体等。
第一节 常用的培养方法
动物细胞生长特性：
第一代细胞培养技术核心问题：难以产业化！
• 一是在工艺生产时不能大规模制备产品；
• 二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性
• 三是难以对同批生产进行生产和质量控制。
• 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞 培养，以便获得大量有用的细胞表达产物。 • 采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能 满足所需细胞数量及其分泌产物。 • 自70年代以来，较常见的细胞培养生物反应器 有空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡 搅拌反应器及篮式生物反应器等。 • 80年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养 代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。
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9
3 10
细胞培养反应器 诱生剂 细胞 细胞 浓缩纯化
4
5 提取 纯化 6 产品（肿瘤抗原） 提取 产品（单克隆抗体）
纯化
产品（干扰素）
大规模培养动物细胞的方法：
• 贴壁培养
• 悬浮培养
• 固定化培养
一、贴壁培养（attachment culture）
细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。
1、生长特性：贴壁依赖型细胞在
石蜡切片中底部薄层软蜡包埋法 甲基丙烯酸甲酯包埋标本
微囊型包埋法
5、微囊法（microencapsulation）:
用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状 的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及 营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小 培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少 受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径 控制在200-400μm为宜。
逐渐成为动物细胞大规模培养的新方向。
三、固定化培养（immobilization culture）：
将动物细胞与水不溶性载体结合起来， 再进行培养。上述两大类细胞都适用，具 有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能 力强等优点，细胞易与产物分开，有利于 产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附 法、共价贴附法、离子/共价交联法、包 埋法、微囊法等。
要求具有净阳电荷和高度表面活性。 对微载体而言还要求具一定电荷密 度；若为有机物表面，必须具有亲 水性，并带阳电荷。
5、贴壁培养系统：
主要有转瓶、中空纤维（后面专题介绍）、 玻璃珠、微载体系统（后面介绍）等。
贴壁培养细 胞转瓶机
细胞转瓶培养器
转瓶培养系统：
为最初采用系统，一般用 于小量培养到大规模培养的过 渡阶段，或作为生物反应器接
操作简单，培养周期短，染菌和细胞突变的风险小
直观反映细胞生长代谢的过程。
可直接放大。
• 细胞的生长分：延滞期、对数生长期、减 速期、平稳期和衰退期五个阶段。
• 分批培养的周期多在3-5天，细胞生长动力 学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h） 细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗 竭或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰 退期进而死亡，表现出典型的生长周期。 收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经 死亡后进行。
动物细胞大规模培养技术：
（large-scale culture technology）
定义：指在人工条件下（设定pH、温度、 溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大 量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
通过大规模体外培养技术培养哺乳类 动物细胞是生产生物制品的有效方法
可大规模培养的动物细胞
●产物体积不断增长；
●可控制衰退期与下降期。
连续式培养
3、优点： 培养状态恒定，细胞在稳定状态下生长。
稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。 在稳定状态下细胞所处的环境条件可维持不变（如
营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以 及细胞比生长速率）。
二、流加式培养（feeding culture）
细胞初始接种的培养基体积一般为 终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据 细胞对营养物质的不断消耗和需求，流 加浓缩的营养物或培养基，通常在细胞 进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整 个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓 缩、纯化目标蛋白。
1、流加培养物的方式
贴壁的单核细胞 “贴壁单核”细胞培养
贴壁细胞
细胞培养的人参愈伤组织
知识回顾
一般步骤：
动物细胞培养步骤
无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净
以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块
将小组织块置解离液（含蛋白酶类）离散细胞。
低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养
植物细胞（组织）培养流程
悬浮细胞培养
三、半连续式培养（semi-continuous culture）
1、又称重复分批式培养或换液培养。采用机
械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。 在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一 段时间，从中取出部分培养物，再用新的 培养液补足到原有体积，使反应器内的总 体积不变。
2、半连续式特点：
●培养物的体积逐步增加；
1、常见的悬浮培养模式：采用机械搅拌式 生物反应器系统。在细胞达最大密度之前， 以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培 养基（防止衰退期出现）；同时，含有细 胞的培养物以相同的速度连续从反应器流 出，以保持培养体积的恒定。理论上讲， 该过程可无限延续下去。
2、连续式培养的特点：
●细胞维持持续指数增长；
收集细胞
提取纯化 产物
药物制剂
脱分化：离体植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间 后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织（细胞排列疏松而无 规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）。 通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、 紫草素、人参皂甙等
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大 规 模 动 物 细 胞 培 养 工 艺 流 程 图
流加的时间通常在指数生长后期，细胞进入衰退 期之前，添加高浓度的营养物质。可以添加一次， 也可添加多次，凡是促细胞生长的物质均可以进 行添加。流加的总体原则是维持细胞生长相对稳 定的培养环境，营养成分既不过剩而产生大量的 代谢副产物造成营养利用效率下降而成为无效的 利用；也不缺乏导致细胞生长抑制或死亡。