离心技术2015.9
离心技术
离心技术离心技术是根据颗粒在匀迷圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。
1．用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟5000转以下。
2．用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以及对纯化样品的有关性能进行研究。
一、基本原理1．离心力Centrifugal force (F)F=mω2rω：旋转角速度(弧度／秒) r:旋转体离旋转轴的距离(cm)m：颗粒质量2．相对离心力Relative centrifugal force (RCF)RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数RCF=F离心力／F重力= mω2r/mg= ω2r/gg为重力加速度(980．70g/sec2)同为转于旋转一周等于2π弧度，因此转子的角速度以每分钟旋转的次数(每分钟转数n 或r/min)表示：一般情况下，低速离心时常以r／min来表示，高速离心时则以g(或数字Xg)表示。
用“X g”表示每分钟转速可以真实反映颗粒在离心管不同位置的离心力。
Dole&Cotzias 制作了转子速度和半径相对应的离心力列线图(图2—15)。
3．沉降系数Sedimentation coefficient (S)当转子内样品绕着旋转轴离心时，样品沉降率是由样品颗粒的大小、形状、密度和溶剂的粘度、密度以及离心加速度决定的，在一般情况下，样品的沉降特征可以用沉降系数来表示：S：是指单位离心场中粒子移动的速度。
S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时间。
S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒，1S二1×10-13秒。
对一定的样品，在一定的介质中，样品沉降系数S 也常保持不变。
文献中常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。
离心技术
水溶性大 性质稳定 渗透压较高 最高密度可达1.33g/ml, 价格低 容易制备, 常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料 有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。
2.聚蔗糖: Ficoll
velocity centrifugation)
利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别, 在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增 加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、 形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后倾倒的办法把 上清液与沉淀分开,然后将上清液加高转速离 心,分离出第二部分沉淀,如此往复加高转速, 逐级分离出所需要的物质。
温度控制是由安装在转头下面的红外线射量 感受器直接并连续监测离心腔的温度，以保 证更准确更灵敏的温度调控，这种红外线温 控比高速离心机的热电偶控制装置更敏感， 更准确。
超速离心机装有真空系统，当速度在40000 rpm以上时，由磨擦产生的热量就成为严重问 题，为此，将离心腔密封，并由机械泵和扩 散泵串联工作的真空泵系统抽成真空，温度 的变化容易控制，磨擦力很小，这样才能达 到所需的超高转速。
rav=( rmin＋rmax) / 2
在离心管的不同部位距旋转中心轴的距 离也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各 不相同
设40000rpm时 R1最小、 3.8cm R2平均、 5.9cm R3最大、 8.1cm RCF值分别 67,910g 105,400g 144,700g
R1 R2 R3
超速冰冻离 心机 2.5-8万或更 高
20
高速冰冻离心机
台式高速离心机
BECKMAN Avanti J-20XPI冷冻高速离心机
二、离心机的结构
１、转动装置 ２、离心转头 ３、离心管 4、 温度控制和制冷系统 5、 真空系统 6、 离心室 7、 安全监测系统
超现代实验技术：离心技术
超速离心技术超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。
离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。
离心技术可分为制备型和分析型两类。
在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质，如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等。
也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。
处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。
离心技术的范围相当广泛。
目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸。
因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。
自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机（45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间，离心机的发展是非常迅速的。
特别是在50年代以后发展的更快，例如，美国贝克曼（Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE），日本的日立（HITACHI）公司以及德国的海吕斯（Heraeus）公司，都生产出各种离心机产品，如普通离心机、高速离心机和超速离心机。
从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。
美国贝克（Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制，分离-检测，全部实现自动化；最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。
此外，离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。
虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。
在实际工作中用的最多的还是制备型离心。
本课程主要介绍制备型分离技术。
离心技术
五、离心机使用注意事项 使用前应将负荷平衡， 1. 使用前应将负荷平衡 ， 重量误差越小 越好 严禁空转， 2. 严禁空转，启动时转速由低至高逐步 调节，严格高速启动。 调节，严格高速启动。 选择合适的转头，控制转速。 3. 选择合适的转头，控制转速。 保护转头，防止碰撞、擦伤、 4. 保护转头，防止碰撞、擦伤、防止异 污垢进入、用毕立即清洁。 物、污垢进入、用毕立即清洁。 低温离心样品时, 5. 低温离心样品时 , 先将空转头预冷一 定时间。温度± 定时间。温度±0℃。 发现异常如噪声，应立即停机检查。 6. 发现异常如噪声，应立即停机检查。 离心机结构及使用方法——实习 六、离心机结构及使用方法 实习 离心机的应用——自学 七、离心机的应用 自学
2、离心机的分类 ：按离心机应用范围分为四类： 、 离心机的分类：按离心机应用范围分为四类： 普通离心机、专用离心机、制备离心机和分析用离心机， 普通离心机、专用离心机、制备离心机和分析用离心机， 按离心速度即离心机转速分为： 按离心速度即离心机转速分为： 普通离心机：转速小于5000转/min，在室温下运 ① 普通离心机：转速小于 转 ， 主要用于红细胞，微生物细胞，粗大沉淀物， 行，主要用于红细胞，微生物细胞，粗大沉淀物，细胞 细胞膜等的沉淀分离。 核、细胞膜等的沉淀分离。 高速离心机：转速为5000～20000转/min，通常 ② 高速离心机：转速为 ～ 转 ， 备有致冷和温控装置。适用于各种生物细胞、病毒、 备有致冷和温控装置。适用于各种生物细胞、病毒、血 清蛋白等有机物、无机物溶液， 清蛋白等有机物、无机物溶液，悬浮液及胶体溶液等样 品的分离，浓缩、提取制备工作。 品的分离，浓缩、提取制备工作。它是细胞和分子生物 水平研究的基本工具。 水平研究的基本工具。 ③ 超 速 离 心 机 ： 转 速 为 20000 ～ 90000 转 /min 。 Ultrcentrifuge因它能产生超强的离心力场而达到独特的 因它能产生超强的离心力场而达到独特的 分离纯化目的。它是分离、纯化、分析、 分离纯化目的。它是分离、纯化、分析、鉴定生物大分 子的重要技术手段 。 如 DNA/RNA 杂交分子的分离 ， HDL的分离。 的分离。 的分离
离心技术的原理及应用
离心技术的原理及应用1. 离心技术的概述离心技术是一种以离心力为基础的分离过程，通过利用离心力将混合物的不同组分分离出来。
离心技术被广泛应用于生物化学、制药、环保、食品加工等领域，可用于固体颗粒的分离、液相溶液的分离、精炼和浓缩等。
2. 离心技术的原理离心技术的原理基于离心力的作用。
离心力是由于转动物体的离心力产生的一种力。
物体在离心力作用下，会被推向物体固定轴线的外侧，形成离心效应，使得混合物的不同组分被分离开来。
离心技术通常通过离心机实现。
离心机的核心部件是转子，可以用来容纳试样。
转子围绕着离心机轴线高速旋转，产生强大的离心力，使得试样中的不同组分被分离开来。
3. 离心技术的应用离心技术在各个领域都有广泛的应用，下面列举了其中几个常见的应用：3.1 生物化学领域•分离DNA / RNA：离心技术可以用于从细胞中分离出DNA或RNA，用于基因测序、基因工程等领域的研究。
•分离蛋白质：离心技术可以用于从混合的生物样本中分离出特定的蛋白质，用于进一步的分析和研究。
3.2 制药领域•药物纯化：离心技术可以用于从化学合成或发酵得到的混合药物中分离出纯的活性成分。
•药物制剂：离心技术可以用于将固体颗粒与液体分离，制备出药物颗粒或胶体。
3.3 环保领域•污水处理：离心技术可以用于将污水中的固体颗粒与液体分离，提高水质。
•垃圾处理：离心技术可以用于将垃圾中的有机物与无机物分离，实现垃圾的资源化利用。
3.4 食品加工领域•榨汁：离心技术可以用于将水果中的果汁与果渣分离，制作果汁。
•提取物质：离心技术可以用于从食材中提取有营养或有药用价值的物质，用于食品加工。
4. 离心技术的优点•分离效果好：离心技术可以将混合物中的不同组分快速、高效地分离出来。
•操作简单：离心技术的操作相对简单，不需要复杂的设备和步骤。
•适用性广：离心技术可以适用于多种样本类型和领域，具有广泛的应用性。
5. 离心技术的局限性•样品量有限：离心技术的样品容量一般有限制，不适合处理大量的样品。
离心技术原理
离心技术原理
离心技术是一种常用的分离方法，它基于物质在离心力作用下的不同沉降速度来实现分离目的。
离心技术的原理主要涉及两个方面：离心力和沉降速度。
首先，离心技术利用离心机产生的离心力来加速分离物质。
离心机通常由一个旋转的容器和一个电动机组成。
当电动机启动时，容器以高速旋转。
由于离心力是与旋转速度的平方成正比的，因此高速旋转能够产生强大的离心力。
离心力是指物体在旋转运动中受到的离心加速度，它的作用是将物质向外推离离心轴线。
离心机的设计目的是使离心力尽可能均匀地作用于容器内的物质，以实现有效的分离效果。
其次，离心技术利用不同物质的沉降速度来实现分离。
沉降速度是指物质在液体中下沉的速度，它取决于物质的密度、形状和粒径等因素。
在离心过程中，由于离心力的作用，密度较大或较大颗粒的物质会沉降得更快，而密度较小或较小颗粒的物质则沉降得较慢。
通过调整离心机的转速和离心时间，可以控制不同物质的沉降速度，从而实现物质的分离。
总之，离心技术利用离心力和物质的沉降速度来实现分离。
离心机通过旋转产生离心力，将物质分离为不同的组分，使得密度大的物质向外沉降，密度小的物质留在上层。
离心技术在生物医学、化学、环境等领域具有广泛的应用，例如可用于细胞分离、DNA提取、蛋白质纯化等。
离心技术
一、基本原理
沉降-扩散平衡： 沉降-扩散平衡： 利用沉降-扩散协同作用可将不同质量的物质分开； 利用沉降-扩散协同作用可将不同质量的物质分开；
自然条件下的沉降是由重力场作用，重力场强度有限， 自然条件下的沉降是由重力场作用 ， 重力场强度有限 ， 当 质量小到一定程度时，沉降速度<<扩散速度， <<扩散速度 质量小到一定程度时，沉降速度<<扩散速度，微粒就不能沉 降分离。 降分离。 离心：借助高速旋转产生比重力场更大的离心力场, 离心：借助高速旋转产生比重力场更大的离心力场,加大沉 淀作用，使更小的微粒也能沉淀。 淀作用，使更小的微粒也能沉淀。 离心力场的优点: 离心力场的优点 *远大于重力场 远大于重力场 *可调节大小 可调节大小
水平转头
垂直转头
o转头停止和运动时， 转头停止和运动时， 离心管都是呈垂直放 置的， 置的，适合用于密度 梯度离心。 梯度离心。 o特点；离心结束时， 特点；离心结束时， 液面和样品区带要作 九十度转向， 九十度转向，因而降 速要慢。 速要慢。介由于样品 颗粒沉降距离最短， 颗粒沉降距离最短， 离心所需时间也短。 离心所需时间也短。
第二节 制备离心技术
（一）差速离心法
1Hale Waihona Puke 差速离心法：逐渐增加离心速度, 或低速与高速交替进行离心，使沉降系数 差速离心法：逐渐增加离心速度, 或低速与高速交替进行离心， 不同的颗粒在不同速度或不同离心时间下分离的方法。 不同的颗粒在不同速度或不同离心时间下分离的方法。 2、特点：离心介质的浓度均一；离心速度改变 特点：离心介质的浓度均一； 3、用途：用于分离大小相差10S的样品颗粒的初步分离 用途：用于分离大小相差10S 4、优点：操作容易，通过倾倒就可将上清液和 优点：操作容易， 沉淀分离，而且可用大容量的角转子。 沉淀分离，而且可用大容量的角转子。 • 缺点：需经多次离心，沉淀不纯，分离效果差， 缺点：需经多次离心，沉淀不纯，分离效果差， 沉淀大量堆集在离心管底部， 沉淀大量堆集在离心管底部，颗粒受挤压 易失活。 易失活。 5、应用中的主要问题：离心时间和离心速度的选择 、应用中的主要问题：
第九章 离心技术
ω 是指该转头的最大允许角速度
S，T 和K之间的关系
K 最高转数 T =--------------- x (----------------)2 S 实际转数
二. 离心设备 离心机
转子 离心管 附件
（一）.离心机(Centrifugel) 1.低速离心机 转子 电动机
转子带有放置离心管的孔 转子的中央位于离心机的驱动轴上 离心机的转速和温度控制不够准确 一般最高转速在6,000rpm以下 实验室中常用于分离制备。
离心技术的基本目的
1.最大程度地富集目的颗粒。 2.最大程度地减少非目的颗粒。
问题是在同一离心力作用下,所有的颗粒均会以 不同的速度沉淀。如何能够有效的达到上述的 基本目的，这就是我们要考虑和必须回答的问 题。
3.沉降系数 Sedimentation icient (S) 样品沉降率 样品颗粒的大小 形状 密度 溶剂的粘度、密度 离心加速度
若用 ω=
2πn (rad/sec) 60
(2πn/60)2
RCF= x r 980.7 =1.118×10-5 n2 r n：转子每分钟的转数(rpm)
影响离心力的两大因素
1. 离心机转数（rpm） 2. 离心半径（r ）
换用不同型号的离心机时，你不能只考虑 离心机转数而忽视离心机半径。不同型号 和半径的离心机在相同转数时会产生大小 不同的离心力，也就会产生不同的离心效 果。
澄清时间（T值）--2
1 Lnrt - Lnr0 t1-t0 = ---- x ---------------S
ω2
澄清时间与颗粒的沉淀系数S成反比， 与离心机的重要参数（ Lnrt - Lnr0） /ω2成正比，即与所使用的离心机或 使用的转头有关。
离心技术工作原理
离心技术工作原理离心技术是一种常见的工程技术，它的工作原理是基于离心力的运用。
离心力是一种向心力的反作用力，它使物体沿着曲线运动时远离曲线的中心。
离心技术利用离心力来实现物质的分离、浓缩和纯化等目的。
离心技术的工作原理可以简单地描述为：通过旋转运动产生离心力，然后利用离心力对物质进行分离。
具体来说，离心技术通常包括以下几个步骤：将待分离的混合物加入到离心设备中，通常是一个圆盘或圆柱形的容器。
然后，通过电机或其他动力源使离心设备高速旋转起来。
旋转运动会产生离心力，离心力的大小与旋转速度和离心设备的几何形状有关。
接下来，由于离心力的作用，混合物中的不同组分会受到不同的力，从而产生不同的运动轨迹。
通常，较重的组分会沉积在离心设备的底部，而较轻的组分则会向上移动。
这样，通过调整离心设备的设计和运行参数，可以实现对混合物的分离。
根据需要，可以采取不同的方法将分离出的物质收集起来。
例如，可以通过改变离心设备的速度或倾斜角度来控制分离效果，或者通过在离心设备中添加分离介质来增强分离效果。
此外，还可以采用不同的收集装置或分离装置，例如收集管、分液漏斗等。
离心技术在各个领域都有广泛的应用。
在生物医药领域，离心技术常用于细胞培养、血液分离和蛋白质纯化等方面。
在化工工业中，离心技术被用于分离溶液中的悬浮物、提取物质和浓缩溶液等。
此外，离心技术还在食品加工、环境监测和科学研究等领域得到广泛应用。
总的来说，离心技术通过利用离心力来实现物质的分离和纯化，具有简单、高效、可控性强等优点。
它在科学研究和工程实践中的应用广泛，为人类的生活和发展提供了重要支持。
离心技术简介
离心技术简介1.离心技术悬浮在液体中颗粒的运动速度取决于：①应用力——液相中的颗粒处在一支平稳的试管内，会受到地球重力的作用而运动。
②固液相的密度差——密度小于液相的颗粒悬浮在上面，密度大于液相的颗粒则沉降下来。
③颗粒的大小与形状。
④介质的黏滞度。
就大多数生物颗粒（细胞、细胞器或分子）而言，受重力作用的悬浮或沉降的速度太慢，就无法应用于物质速度（g＝ m·s－2）的倍数的分离。
所以常使用离心机对物质进行分离。
离心机是一种通过使样品绕离心转轴的中心旋转而在其上产生一个远大于地球重力的仪器。
不同大小、形状和密度的颗粒会以不同的速度沉降。
颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及颗粒与中心轴的距离。
2.离心分离常见的一些方法（一）差速沉降（沉淀）法将一混合悬浮液以一定的RCF（RCF又称为相对离心力，RCF取决于转子的转数和旋转半径），离心一定的时间后，混合物将会被分为沉淀和上清液两部分。
这种方法被广泛应用于从细胞匀浆中分离细胞器。
（二）密度梯度离心法下列技术使用了密度梯度，即离心管中的溶液从管顶到管底密度逐渐增加。
①差速区带离心法。
将样品置于平缓的预制备的密度梯度介质上，进行离心，较大的颗粒将比较小的颗粒更快地沉降，通过梯度介质，形成几个明显的区带（条带）。
这种方法有时间限制，在任一区带到达管底之前必须停止离心。
②等密度离心法。
这种技术根据其浮力密度的不同分离物质。
几种物质可通过离心法形成密度梯度（如蔗糖、CsCl等）。
样品与适当的介质混合后离心——各种颗粒在与其等密度的介质带处形成沉降区带。
这种方法要求介质梯度应有一定的陡度，要有足够的离心时间形成梯度颗粒的再分配，进一步离心对其不会有影响。
使用一根细的巴氏滴管或带有细长针头的注射器可收集一个密度梯度内的条带。
另一种方法可将试管刺穿，将内含物分段逐滴收集到几个管中。
需要更精确的研究时，可以再进行更精确的分离。
(参考资料)离心技术
一.离心技术 (Centrifuge)
利用溶液中颗粒密度、大小等特性，用旋转产生的 离心力使不同特性颗粒从溶液中分离并沉降，从而 达到分离、浓缩、提纯和鉴定的目的，称为离心技 术。
* 分离细胞或其他的悬浮颗粒；
* 从组织或细胞匀浆中分离细胞器； * 分离病毒和大分子，包括DNA、RNA、蛋白质和脂类。
特点： 密度梯度介质，且密度较低，
介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最 小密度( p> m )。
离心时间(t)，不能使所有颗粒都沉到管底。
24
密度梯度离心-等密度梯度离心法
（isodensity centrifugation)
原理：离心时采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质， 被分离颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成 一系列区带，然后从管底收集。
22
密度梯度离心-移动区带离心法
（moving-zone centrifugation)
原理：用梯度蔗糖或甘油作为介质，将 要分离的样品放在介质表面，形成一个 狭带，然后超速离心，使不同密度的颗 粒以不同的速度向管底方向移动，形成 一系列区带，从管底小孔中分次收集各 种颗粒成分。
23
用途： 分离有大小和密度差异的细胞或细胞器。
dx/dt
s（秒）=
= 2r2(p- m)
w2x
9
dx: 颗粒与转轴中心的距离 r: 颗粒直径
dt：颗粒沉降所需时间
w: 角速度 X: 转子半径
p : 颗粒密度 m : 溶液介质密度 ： 溶液介质粘度
S =1×10-13s
8
决定沉降速度的因素：
颗粒大小；颗粒密度；溶液介质密度和粘度
9
2.相对离心力（RCF）：重要指标
离心技术的应用综述
离心技术的应用综述离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。
这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。
一、基本原理的分类（一）基本原理⒈离心力（centrifugal force，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。
离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。
⒉相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。
RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数（rpm）。
在上式的基础上，Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图，见图16-4，在用图16-4将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。
例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。
⒊沉降系数（sedimentation coefficient，s）根据1924年Svedberg 对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。
离心技术
主要用于样品作密度梯度离心，如用于线粒体、 叶绿体、细胞核等的分离和密度梯度离心。
3、区带转子 区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开 的顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装置，把 桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管， 梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过 这些导管分布到转子四周。 分离效果好 转速高 容量大 回收梯度容易 不影响分辨率
Dole和Cotzias制作了与离心机转子速度和半径相对 应的RCF的列线计算图
将离心机转数换算 为RCF时，首先，在 标尺上取已知的 和 在r/min标尺上取已 知的转数，然后， 将两点间划一条直 线，在图中间RCF标 尺上的交点即为相 应的RCF（g）。
半径 RCF 转速 r/min
二、浮力
电动机 转子 驱动和速度控制 温度控制 真空系统 20000～25000rpm 50000～80000 rpm 89000×g 510000×g
容量
几十毫升至 几升
3升
几十毫升至2升
三类制备性离心机的比较
特性 低速离心机 高速冷冻离心机 超速离心机 差速沉降分离 和密度梯度区 带分离 分离形式 固液沉降分离 固液沉降分离
应用及特点 差速离心法适用于大小和密度相差较大、不稳 定、易变性、易受梯度介质损伤的颗粒。 差速离心的分辨率不高,沉淀系数在同一个数量 级内的各种粒子不容易分开,常用于其他分离手 段之前的粗制品提取。
应用及特点 优点
操作简单 可使用容量较大的角式转子 分离时间短、重复性高 样品处理量大
2. 生物、医学、化学
转速从每分钟几千到几万转以上，目的在
于分离和纯化样品，以及对纯化的样品有关性能进
行研究。
第一节
离心分离的基本原理
超现代实验技术：离心技术
超速离心技术超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。
离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。
离心技术可分为制备型和分析型两类。
在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质,如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等。
也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。
处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。
离心技术的范围相当广泛.目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸.因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。
自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机(45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间,离心机的发展是非常迅速的.特别是在50年代以后发展的更快，例如，美国贝克曼（Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE），日本的日立（HITACHI）公司以及德国的海吕斯（Heraeus)公司,都生产出各种离心机产品,如普通离心机、高速离心机和超速离心机.从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。
美国贝克(Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制,分离-检测,全部实现自动化;最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。
此外，离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。
虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。
在实际工作中用的最多的还是制备型离心。
本课程主要介绍制备型分离技术。
离心技术
离心技术
一、 基本原理
生物样品悬浮液在高速旋转下，由于 巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗 粒以一定的速度沉降，从而与溶液得 以分离，而沉降速度取决于颗粒的质 量、大小和密度。
概念
离心力 F = m· = m· 2 r a ω 相对离心力（RCF）：在离心场中，作用于颗粒的离心 力相当于地球重力的倍数，单位是 “g” 低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速时以“g” 表 示。 RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r 沉降系数(S)：单位离心力场中粒子沉降的速度，秒。 1S=10－13s，用S可以近似表示分子量 。
衡，寿命较长。但出现 “壁效应” 。
⑵ 荡平式转子：有利于离心结束后由管内分
层取出已分离的各样品带，但需时间长 。
⑶ 区带转子：分离效果好，但耐腐蚀要求高，
操作复杂 。
⑷ 垂直转子：离心所需时间短，但降速慢。
离心技术
离心机的主要构造和类型
离心管：离心管主要用塑料和不锈钢制成
离心前管盖必须盖严，管盖有三种作用：
离心技术
1、差速沉降离心法：
用于分离沉降系数相差较大的 颗粒和粗制品提取。
优点：操作简易，可使用容量 较大的角转子。 缺点：分离效果差，沉淀于管 底的颗粒容易变性失活。
已破碎的细胞
500g,10’
沉淀（细胞核）
上清液
10 000g,10’
上清液 沉淀（细胞膜碎片、 线粒体、溶酶体） 沉淀（核糖核蛋白体）
100 000g,3h
上清液（可 溶性组分）
制备性超速离心的分离方法
2. 密度梯度区带离心法（区带离心法）：
将样品加在惰性梯度介质（蔗糖或氯化铯 等）中进行离心沉降或沉降平衡，在一定 的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定 位置上，形成不同区带的分离方法。
离心技术
一、离心技术离心机是利用物质的高速旋转时产生强大的离心力，使置于该旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的目的。
离心机的种类繁多，用途各异。
（一）离心分离的原理需离心分离的生物样品，常预先制成悬浮液。
将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等称为颗粒。
每个颗粒都有一定大小、形状、密度和质量。
当离心转子高速旋转时，这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和力的方向有关。
颗粒除受到离心力外，还受到颗粒在介质中移动时的摩擦阻力与离心力方向相反的浮力，即颗粒处于重力场之下的重力和与重力方向相反的浮力。
此外，还有周围介质小分子的作用力，当颗粒很小时，介质分子对颗粒的作用力十分明显，要使这种小颗粒沉降，需要更大的离心力。
在离心场中，作用于颗粒上的力主要有①离心力（Fc）：离心力的大小等于离心加速度与颗粒质量的乘积。
②重力：是颗粒重力与重力加速度的乘积。
③浮力：是指被物体所排开的周围介质的重量。
颗粒的浮力与离心力方向相反，为颗粒排开介质的质量与离心加速度的乘积。
当离心转子从静止状态加速旋转时，原来处于悬浮状态颗粒的密度大于周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向移动，即发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向移动，即发生漂浮。
无论发生沉降或漂浮，离心力的方向与摩擦阻力和浮力方向相反，当离心力增大时，反向的两个力也增大，到最后离心力与摩擦阻力和浮力平衡，颗粒的沉降（或漂浮速度）达到某一极限速度，这时颗粒运动的加速度等于零。
颗粒的沉降速度与颗粒直径的平方，颗粒密度和介质密度的差值以及离心加速度成正比，而与介质的粘滞度，颗粒偏离球形的程度成反比。
在离心加速度不变的情况下，颗粒的沉降速度主要决定于颗粒的直径大小和颗粒的形状，而颗粒的密度所起作用较小。
颗粒在单位离心力作用下的沉降速度，称为沉降系数，用s表示。
沉降系数的单位以1 10-13s=1Svedberg单位，以1S表示。
第10章 离心技术
三 沉降速度 即在离心力作用下， 即在离心力作用下，物质粒子于单位时间 内沿离心力方向移动的距离。 内沿离心力方向移动的距离。
d 2 (ρ − ρ 0 )ω 2 x υ= 18η
四沉降系数 在单位离心力场中， 在单位离心力场中 ， 颗粒的沉降速度谓之 沉降系数” “沉降系数”
d (ρ − ρ o ) S= 2 = 18η ω χ υ
五、密度梯度技术
（一）密度梯度的作用: 密度梯度的作用 1.增加分离层次，提高分辨率。 增加分离层次， 增加分离层次 提高分辨率。 2.防止温差及振动造成的影响。 防止温差及振动造成的影响。 防止温差及振动造成的影响 （二）对密度梯度的基本要求 梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大， 1 梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密 度范围大的密度梯度。 度范围大的密度梯度。 2 理化性质稳定，生物惰性；离子强度低，渗透压小，粘度 理化性质稳定， 生物惰性； 离子强度低， 渗透压小， 小。 3 具某种可测性（如折射率）以测其浓度（密度），但不干 具某种可测性（ 如折射率） 以测其浓度（ 密度） 扰分离组分的测定。 扰分离组分的测定。 4 便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。 便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。
3．按工作性质分类 （1）制备型离心机 实验室用离心机， （2）实验室用离心机， 4．按操作方式分类 （1）连续离心机 。 （2）人工卸料（出渣）离心机； ）人工卸料（出渣）离心机； 自动卸料离心机（如螺旋式离心机） （3）自动卸料离心机（如螺旋式离心机）
（二）常用离心机 1 普通离心机 2管式高速离心机 管式高速离心机 原理： 原理： 应用：液固，液液， 应用：液固，液液，发酵工程酶工程中分离菌 体
4π 2 N 2 rm RCF = 3600mg 4π 2 N 2r = = 1.118 × 10-5 N 2r ( x g ) 3600 × 980
分析离心技术
分析离心技术现代社会是一个信息化的时代，我们身边几乎每天都会产生或多或少的电子垃圾，因为如今的电子产品越来越先进，所以人们可能会选择将这些产品随手扔掉。
但这样做就大错特错了，因为这些被随手丢弃的电子垃圾中往往含有大量有毒物质。
因此，我们应该寻找新的方法处理电子垃圾。
就在这时，一项专门用于提取有害物质的技术——离心技术诞生了。
其实在科技发展的背后，还有一些耐人寻味的事情，今天，我们就通过离心技术，来认识一下科技发展的成果。
到了19世纪初，离心技术在医学上得到广泛应用。
那时候，法国著名的科学家帕斯卡发明了一种提取心脏里血液的仪器，这种仪器就是现在所说的离心机。
当医生把血液装入离心机中时，便会产生血压升高、心跳加快的现象，最终从人体中分离出血液。
不过，那时候的离心机的工作效率十分低下，每次只能提取10毫升左右的血液，而且离心机工作时十分危险，稍有不慎就会使病人因血液凝固导致死亡。
再来看看离心机吧。
它的外观与普通的冰箱差不多，十分小巧。
离心机内部的构造也很简单，其内部结构主要由两个部分组成：一个是主转鼓，另一个是辅助转鼓。
主转鼓和辅助转鼓之间由一个间隔分开，转鼓中还有一个圆柱形的容纳腔。
容纳腔与主转鼓之间安装有一个速度调节器，它能够根据容纳腔的位置变化自动调节离心机的转速。
而在离心机的底部安装有一个托盘，托盘上面装有许多螺旋推进器，这些推进器呈“八”字形排列，每条直线上又布满着许多条间隔。
在这些推进器中有一个叫做二级推进器的装置，它是离心机中最重要的部分，它负责将辅助转鼓内的液体压向主转鼓，并通过离心力将液体甩到底部的出液口。
在离心机工作时，这些推进器就好像钟表的发条一样，随着主转鼓转速的增加，发条被拉伸和压缩，从而将离心机内部的液体压向主转鼓。
正是依靠离心机转鼓内部的这种奇妙的机械运动，才使得离心机可以将更多的物质从人体中分离出来，达到提取物质的目的。
直到19世纪中期，医生们才将这种设备改造成功，离心技术也逐渐进入医学领域。
实验三 离心的技术
实验三离心技术一．概念生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离的一种技术。
沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。
主要应用于各种生物样品的分离和制备。
二．基本原理1．离心力（F）F = m·a ＝m·ω2r2a：粒子旋转的加速度m：粒子的有效质量克为单位ω：粒子旋转的角速度弧度/秒为单位r：粒子的旋转半径cm为单位2．相对离心力（RCF）relative centrifuge force通常离心力常用地球的引力的倍数来表示，因而称为相对离心力（RCF）。
或者用数字×g 来表示，例如：13，000g，则表示相对离心力为13，000。
相对离心力指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（980cm/s2）。
RCF=ma/ mg= mω2r2/mg=ω2r2/gω=2π×rpm/60∴RCF=1.119×10－5×（rpm）2rrpm：revolutions per minute为每分钟转数由上式可知，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。
由于转头的形状及结构的差异，每台离心机的离心管从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半径r av代替：rav＝（r min＋r max）/2低速离心时常以转速rpm来表示，高速离心时则以g表示。
报告离心条件时使用RCF 比rpm要科学，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。
三．离心机的主要构造和类型1．离心机的分类工业用离心机制备性离心机：分离各种生物材料、分离的样品量比较大实验用离心机分析性离心机：研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，一般有光学系统，可监测粒子在离心场中的行为，能推断物质的纯度、形状和分子量等，都是超速离心机制备性离心机分为：（1）普通离心机最大转速6000rpm左右，最大RCF接近6000g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，室温操作，用于收集易沉淀的大颗粒物质，如：细胞等（2）高速冷冻离心机转速为2000－25000rpm，最大RCF为8900×g，最大容量可达3L，一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0℃－4℃，可以严格准确的控制转速温度和时间，并有指针或数字显示。
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例：沉降某颗粒需10000g.min 10000g 1min
2000g
5min
离心分离首先需要知道的3要素
颗粒的沉降系数
加在颗粒上的相对离心力
离心时间
二.离心设备：离心机及离心管
3.离心腔
（真空设备） 1. 转头 2.控制系统 （马达）
4.温度控制 （冷却设备）
离心机分类
制备型、分析型；
低速：6800g(细胞级） 分离>10000S的细胞及细胞器 如：Beckman公司的J6，GS-6 高速：17,700－50,400g（亚 细胞级） 分离 >100S的颗粒，包括部分 细胞器及病毒, 如：Beckman 公司的J2 超速：90,400－694,000g（分 子级）离<100S的颗粒, 如：Beckman公司的L,XL
上清
上清
上清
上清
大小颗粒混合物
最大颗粒
较大颗粒
中等颗粒
小颗粒
用途： 分离大小相差悬殊的细胞和细胞结构成分。
特点： 介质密度均一；
速度由低向高，逐级离心；
操作简单； 分离纯度不高。
密度梯度离心法
离心介质有密度梯度
s= 2r2(p- m) 9
理想的离心介质
可自行配制的：蔗糖、
商品化的：Ficoll, Percoll, Accudenz (Nycodenz),
溶酶体、过氧化物酶体、高尔基膜、大的高密度小泡 细胞膜、高尔基体、内体等
差速离心需要的设备
离心机：低速、高速、超高速
转头：
固定角、垂直或水平
介质：
蔗糖
密度梯度离心
梯度离心需要的设备
离心机：低速、高速、超高速
转头：
介质：
水平、固定角、垂直 Metrizoate
蔗糖、Ficoll, Percoll, Accudenz (Nycodenz),
3.等密度梯度离心法
（isodensity centrifugation)
原理：
离心时采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，被分离 颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成一系列 区带，然后从管底收集。
s=
2r2(p- m) 9
用途： 分离密度不等的颗粒,适用于病毒、DNA、RNA、 蛋白质等，效果只与颗粒密度有关，与大小无关。 特点： 密度较高介质，陡度大，介质的最高密度应 大于被分离组分的最大密度( p< m ) 。 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍， 往往需要高速或超速离心。
溶液（细胞结构成分）：颗粒溶液、大小、密度特性
设备：
离心机、离心介质
3个因素： 沉降系数 相对离心力
离心时间
1.沉降系数（S）：重要指标
颗粒在单位离心力的作用下的移动速度
s(秒）=
dx/dt
w2x
=
2r2(p- m)
9
r: 颗粒直径
dx: 颗粒与转轴中心的距离
dt：颗粒沉降所需时间
W: 角速度 X: 转子半径
常温、低温；
台式、立式； 低速、高速、超速
OptimaTM L-XP（Beckman Coulter)
制备型超速离心机
Max RPM Max Force (x g) 100000 802400
1.离心机转头:离心技术的核心
性能指标： (1) 离心力：能达到的RCF；
(2) 离心效力：K因子：k值越小，离心时间越
6.举例:线粒体分离
原理： 线粒体特征：体积较大，沉降系数较大； 类似大小的细胞器较多，但密度有差别。
分离设计：
• 细胞破碎（机械匀浆） • 差速离心，必要时密度梯度离心
（1）从大鼠肝脏组织中制备线粒体
细胞破碎：匀浆缓冲液（MS缓冲液，等渗） ：0.21M甘露糖
5mM Tris-HCl pH7.5, 70mM 蔗糖, 1mM EDTA
转头损坏及原因
金属疲劳
转子内部的应力改变导致裂纹 注意：安全系数>2；钛合金；转头寿命
超速
测速盘（超速花盘）
化学腐蚀
离心管破裂、样品渗漏
转头不平衡
离心管平衡误差0.01g；离心管放置不对称；水平转 头吊桶盖安装不当；转头不加盖；“O“形密封圈失效
离心管帽、垫圈、接合器使用不当
三.离心方法
根据离心介质有无梯度：
长
分 离 纯 度
高
水平转头
Beckman 公司转头的标记
SW: 水平转头,如SW50.1；
V：
垂直转头,如V Ti80；
NVT: 近垂直转头； Type: 固定角转头,如Type80Ti JA: JS: 使用在J系列的固定角转头，如JA.2 使用在J系列的水平转头，如JS.13.1
数字：最高安全转速（×1000）； Ti: 钛合金，未标记为铝合金
From “Current protocols in cell biology”
四.细胞结构成分的分离
1. 细胞沉淀
2.细胞破碎 3.细胞结构成分的分离－离心技术 4.分离细胞器的鉴定和评价 5.举例：线粒体分离、细胞核分离(略）
1.细胞沉淀（cell pellet)
1. 介质密度为1g/ml;
p : 颗粒密度
m : 溶液介质密度
： 溶液介质粘度 1S=1×10-13s
决定沉降速度的因素：
与颗粒大小有关；与颗粒密度有关；
与溶液介质密度和粘度有关。
密 度
沉降系数
2.相对离心力（RCF）：重要指标
离心分离时，作用在悬浮颗粒上的力常用RCF数值表 示，即同一颗粒在离心时的离心力同地球重力相比 较后得到的值。
细胞膜
5’-核苷酸酶、Na/K-ATP酶
6.举例:细胞核分离
原理：
细胞核特征：体积大，沉降系数大；
密度高，可通过浓蔗糖，分离容易。 分离设计： • 细胞破碎（机械匀浆，渗透溶胀，表面活性剂），
释放细胞核，光镜鉴定释放效果。
• 离心，光镜鉴定分离效果
从组织中制备细胞核 细胞破碎：裂解缓冲液：0.25M蔗糖，
Potter-Elvehjem或Dounce匀浆器/松型槌；
（时间长，纯度高）
5.分离细胞器的鉴定和评价
（1）形态鉴定：光镜或电镜 （2）生化分析：细胞器特异的标志酶
(2)生化分析：细胞器特异的标志酶
细胞器
细胞核
标志酶
NAD合成酶、DNA聚合酶
线粒体
溶酶体 过氧化物酶体 内质网 高尔基体
细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶
酸性磷酸酶、－半乳糖苷酶 过氧化氢酶、尿酸氧化酶 葡萄糖-6-磷酸酶、细胞色素P450 －半乳糖苷转移酶
细胞结构成分分离的离心技术
一.离心技术原理 二.离心设备 三.离心方法 四.细胞结构成分的分离
离心技术发展和细胞器分离
1938 Behrens nuclei and cytoplasm from liver cells (differential centrifugation) 1951 Brakke 1954 De Duve plant virus (density-gradient centrifugation ) lysosomes, peroxisomes
10mM Tris-HCl pH7.4, 10mM NaCl （低渗）, 3mM MgCl2,
1mM DTT, 0.5mM PMSF。
组织研磨器；
肝脏组织切成1cm3小块，装入缓冲液中，倒入研磨器
离心：
浓蔗糖溶液：2M蔗糖
组织匀浆产物和浓蔗糖溶液等体积混合
23 000g， 30min， 4°C(白色沉淀)，水平转头(SW)
介质的梯度形成装置和收集装置
4.离心方法的选择
根据分离细胞器的性质：
匀浆物中各类细胞器大小不同：
差速离心
上清中各类细胞器大小有差别：
速率区带离心
上清中各类细胞器密度有差别：
等密度离心
4.离心方法的选择
根据研究目的： 分析分离：差速离心
（时间短；介质浓度低，对细胞结构成分损伤小） 制备分离：密度梯度离心
细 胞 培 养 和 离 心 技 术
细胞结构成分分离的离心技术
Subcellular fractionation
一.离心技术原理
二.离心设备
三.离心方法
四.细胞结构成分的分离（略）
一.离心技术原理 （Centrifuge)
利用溶液中颗粒密度、大小等特性，用旋转产生的离心 力使不同特性颗粒从溶液中分离并沉降，从而达到分离、 浓缩、提纯和鉴定的目的，称为离心技术。
介质 密度 逐渐 增高
s=
2r2(p- m) 9
用途： 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 分离效果只与颗粒大小有关，与密度无关。 特点： 密度梯度介质，且密度较低， 介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最 小密度( p> m )。
s=
2r2(p- m) 9
离心时间(t)，不能使所有颗粒都沉到管底。
差速离心
差速离心形成的沉淀（肝脏）
沉淀
P1
P2 P3 P4 P5 P6
RCF×时间
1000g*10min
3000g*10min 6000g*10min 10，000g*10min 20，000g*10min 100，000g*10min
内容物
细胞核、重线粒体、大片细胞膜
重线粒体、细胞膜碎片 线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、完整高尔基体 线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、高尔基膜
2. 一般细菌和动物细胞密度为1.08-1.12g/ml,
病毒密度为1.18-1.31 g/ml。
3. 相对离心力 (g)和离心时间（min)决定沉降
材料 动物细胞 人红细胞 大小(m) 10-60 6- 8 离心条件(离心力，离心时间） 200-500g 500g 5-15min 5-15min